基因的克隆及其作为内参基因的评价

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

随着分子生物学的发展，基因表达分析在发现和预测新基因及其功能、探究基因表达调控的复杂网络等研究中日趋重要。实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是在传统PCR技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术，具有重复性好、灵敏度高、特异性强、高通量等特点，已成为分子生物学研究中检测基因表达水平的一种重要方法[]。在qPCR分析过程中，RNA的质量、cDNA的质量与起始浓度、扩增效率等都会对结果的准确性产生影响，因此，必须选择合适的内参基因进行校正和标准化[]。理想内参基因应该在特定试验条件下的所有细胞或组织中均相对稳定地表达，不会受到任何内源性或外源性因素的影响。常用的内参基因主要有肌动蛋白基因（ACT）、转录延伸因子基因（EF1α）、α/β微管蛋白基因（TUA/TUB）、18S/25S核糖体RNA基因（18S/25S rRNA）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）等管家基因。近年来随着基因芯片技术和转录组测序等研究的深入，新的内参基因也不断被挖掘，如网格蛋白衔接蛋白复合物基因（CAC）、SAND蛋白家族基因（SAND）、PPR蛋白家族基因（PPR）、F-box蛋白家族基因（F-box）、ABC转运因子基因等[-]。但是，大量研究表明，随着研究对象的不同或者试验条件的变化，没有任何一种内参基因的表达是始终稳定的，即内参基因的选择不存在通用性[]。因此，在研究目标基因的表达情况时，研究者必须首先在具体试验条件下对内参基因进行筛选与验证，然后再选择合适的内参基因用于校准，这是保证qPCR分析结果准确性的重要前提。

珙桐（Davidia involucrata Baill.），又名鸽子树，为珙桐科珙桐属落叶乔木，是我国特有的单型属珍稀孑遗植物，属于国家Ⅰ级保护植物[]。在我国，珙桐主要分布于四川、重庆、湖北、贵州、湖南、云南、甘肃等省市。珙桐是著名观赏树种，具有一些独特的生物学性状，如圆形的头状花序、对生的白色叶状苞片等。对珙桐独特的生物学表型展开研究，从分子生物学水平上阐述其特异器官发育的调控规律，寻找关键调控基因，是珙桐分子生物学研究的重要方向。目前，有关珙桐中关键基因的克隆，基因的表达模式分析及功能研究等相对较少，而在已有的少量报道中，均选择常见管家基因（如ACT、18S rRNA等）作为内参基因，但所选用基因是否适合作为该研究中的内参基因，尚缺乏一定理论依据[, ]。因此，在珙桐分子生物学研究中，需要发掘更多具有较高表达稳定性的内参基因，这对于提高珙桐基因表达研究的准确性至关重要。

CAC（Clathrin adaptor complexes），即AP2M（Adaptor protein-2 Mu-adaptin），是细胞中的一类衔接蛋白（Adaptor protein，AP）。衔接蛋白指在细胞内信号传递过程中，在蛋白质间起连接作用的一类蛋白质，进化上比较保守。植物中共有5种类型的AP复合体，即AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5，每个AP复合体均由2个大亚基（α和β）、一个中亚基（μ）和一个小亚基（σ）组成。其中，AP-2复合体存在于质膜上，在网格蛋白介导的质膜内吞过程中发挥重要作用[, ]。植物中对CAC基因的研究还不够深入，有关其具体生物学功能的报道也较少。但近年来有研究表明，在一些植物中，CAC可作为特定条件下的内参基因应用于基因表达分析中。例如，Czechowski等[]利用拟南芥Affymetrix ATH1全基因组基因芯片数据，筛选出了在拟南芥不同组织以及非生物胁迫下均能稳定表达的22个基因，并结合5个管家基因（ACT2、EF-1α、GAPDH、UBQ10、UBC），对它们的表达稳定性进行评价，结果发现，筛选出的新内参基因的表达稳定性普遍优于管家基因，并且新内参基因CAC（AT5G46630）具有较高的表达稳定性。随后，在番茄、荞麦、竹子、鹰嘴豆、西瓜等植物中的相关研究也表明，CAC可作为内参基因使用[-]。

目前，很多植物的基因表达分析中都选用了CAC作为内参基因，而有关珙桐CAC基因的研究尚未见报道。为此，本研究克隆珙桐CAC基因，并对其进行相关生物信息学分析。同时，结合5个管家基因（ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA），利用半定量PCR、qPCR以及内参基因稳定性分析软件探讨DiCAC在珙桐不同组织的表达稳定性。同时，白色苞片是珙桐代表性状，苞片的发育机制研究是本课题组今后的研究重点，因此也对DiCAC在不同发育阶段苞片中的表达稳定性进行分析，旨在为珙桐分子生物学研究提供新的、稳定的内参基因资源，为进一步研究珙桐的基因表达模式，揭示珙桐苞片发育的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料