基因克隆及其在初情期启动过程中的表达研究
初情期是动物获得繁殖能力的关键阶段[-]，在动物生产上，培育初情期早的母畜可以节约饲养成本，增加母畜终生产仔数量，从而提高母畜利用率，也可以缩短世代间隔，加速育种进程[-]。
Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，最早发现于秀丽隐杆线虫中，是调节线虫发育时间的异时性基因[-]。在哺乳动物中，该基因的同源基因有Lin28A和Lin28B两种，两者有77%的同源性，都含有两个RNA结合结构域：一个冷休克结构域和一对CCHC锌指结构域[]。Lin28A和Lin28B具有相同的功能，呈现不同的细胞类型分布[]。Lin28A、Lin28B可通过多种机制抑制let-7 miRNA的成熟过程，let-7 miRNA可以在转录后水平抑制Lin28A、Lin28B的翻译，降低Lin28A、Lin28B蛋白表达水平。另外，Lin28A、Lin28B还具有独立于miRNA的功能，可选择性地结合mRNA靶基因，从而直接刺激该基因的翻译过程[-]。Lin28A在小鼠、鸡胚胎发育早期和胚胎干细胞中广泛表达，而其在胚胎发育晚期和成年只在心肌、下丘脑、垂体、卵巢、睾丸中表达[]。Lin28A在成年大鼠胎盘、睾丸、卵巢和垂体中高表达，在下丘脑中等程度的表达[]。
研究发现，Lin28/let-7在动物初情期启动中发挥重要调控作用[-]。Moss等[]研究发现，Lin28A基因调节线虫发育过程，Lin28A基因过表达，导致发育延迟，然而，Lin28A基因表达缺少，导致发育提前。Zhu等[]发现，Lin28A基因过表达的转基因小鼠，阴门开口时间和初情期延迟，下丘脑、垂体、卵巢中过表达Lin28A基因，但let-7a或let-7g表达并未下降，且let-7水平并不影响下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)细胞的生长。Sangiao-Alvarellos等[]研究发现，Lin28A mRNA在新生雌、雄大鼠下丘脑中大量表达，在幼年期至初情期的过渡中，表达急剧下降，而let-7a和let-7b在新生雌、雄大鼠下丘脑中表达很少，在幼年至青春期的过渡中，表达急剧上升。Grieco等[]研究发现，与20日龄C57BL/6(B6)小鼠相比，25、30日龄和初情期后，C57BL/6(B6)小鼠卵巢中Lin28A mRNA表达显著下降，下丘脑中Lin28A mRNA表达也显著下降，但let7-a和let-7g miRNA在下丘脑、卵巢中均没有发生显著变化。Lin28A基因在下丘脑、卵巢等的表达呈发育性变化，且达到初情期时表达明显下降，let-7 miRNA表达变化显著或者没有发生显著变化，Lin28A可能通过调控let-7的方式或独立于let-7的方式对下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)进行调节，从而启动初情期到来。
多浪羊是新疆羊肉优良风味的典型代表，也是本地区主要地方绵羊品种和肉食来源。虽然在南疆相同的生态环境条件下，与其他地方绵羊品种相比，多浪羊具有独特的繁殖特点，是新疆典型的早熟品种，母羊3~4月龄达到初情期，常年发情、繁殖性能高[-]，本研究以性早熟的多浪羊为研究对象，对其Lin28A基因cDNA进行克隆，采用Real-time PCR技术分析下丘脑、垂体、卵巢中Lin28A基因在初情期启动过程中的表达变化规律，以进一步揭示Lin28A基因在多浪羊初情期启动中的作用，为从遗传上缩短绵羊的初情期年龄提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及样品采集选择饲养于南疆疆南牧业有限公司、饲养环境条件相同，体重相近，出生日期接近的未发情的雌性多浪羊为试验动物，自90日龄起对母羊进行初情期(第1次发情)观察，参照Dantas等[]和Cao等[]初情期鉴定方法，每天将性成熟公羊(包扎阴茎)放入母羊群中试情2次，发情母羊外部表现为精神不安，爱走动，静立接受公羊爬跨为发情标准，分别在初情期前(第1次发情前1周)、初情期、初情期后(第1次发情后1周)屠宰多浪羊各5只。在无菌条件下用专门处理过的手术器械快速采集下丘脑、垂体、卵巢组织，立即放入液氮保存。
1.2 总RNA提取和cDNA的合成 1.2.1 总RNA提取采用TRIzol-酚-氯仿一步法提取上述采集的下丘脑、垂体、卵巢组织总RNA，利用紫外分光光度法和1%琼脂糖对总RNA浓度和质量进行检测，-20 ℃保存备用。
1.2.2 cDNA的合成按照反转录试剂盒的说明书进行，首先混合总RNA 2 μL(约2 μg)，oligo (dT)18(0.25 μg·μL-1)2 μL，dNTPs (2.5 mmol·μL-1) 2 μL和RNase free H2O 7 μL，然后65 ℃ 5 min，冰浴2 min。再加入5×First-Strand Buffer 4 μL，DTT(0.1 mol·L-1) 1 μL，RNase inhibitor (40 U·μL-1)1 μL，SuperscriptTM Ⅲ反转录酶(200 U·μL-1) 0.6μL，最后加RNase free H2O水补足总体积到25 μL，按照55 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min进行反转录。RT产物-20 ℃保存备用。
1.3 引物合成、PCR扩增根据NCBI中公布的绵羊Lin28A基因mRNA序列(XM_012153431.1)设计引物()，利用垂体组织总RNA，反转录成cDNA, 扩增多浪羊Lin28A基因CDS序列和3′ UTR。RT-PCR反应程序: 95 ℃预变性5 min；95 ℃ 20 s, 60 ℃退火30 s, 35个循环；75 ℃ 5 min。将扩增出的PCR产物凝胶回收、克隆测序，然后用DNA Star软件组装，BLSAT进行序列对比和分析。
表 1(Table 1)
表 1 基因克隆及定量PCR引物
Table 1 Primer sequences of gene cloning and qPCR
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