5p靶向调控

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

microRNA (miRNA)是广泛存在于动植物中的一类非编码的单链小分子RNAs，长度一般为21~25个核苷酸[]。miRNA通过与靶基因mRNA进行完全或不完全的结合，对编码基因的转录后调控起重要作用[]。它们主要通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)结合来抑制靶基因的翻译或降解靶基因[]。miRNA参与大多数生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡以及某些疾病的发生发展过程。因此，通过从miRNA与其靶基因的关系方面入手研究，可为解析二者的功能与机制提供思路。

支链氨基酸(Branched-chain amino acid, BCAA)是动物体内不能合成的，必须从食物中获取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸[]。机体通过对BCAA的分解代谢来维持其稳态水平[]。大多数氨基酸可以在肝中被有效降解，有些则可以在脂肪或肌肉组织中氧化[]。肝氧化是通过线粒体脱氢酶和支链α-酮酸脱氢酶复合体(Branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex, BCKDH)催化BCAA分解[]。BCKDH是催化BCAA分解代谢的一个关键限速酶，由支链α-酮酸脱羧酶(E1)、二氢脂乙酰基转移酶(E2)、二氢脂乙酰脱氢酶(E3) 3个催化元件及BCKD激酶和BCKD磷酸酶2种特殊的调节酶组成[]。其中，E1由α、β 2个亚基(E1α、E1β)组成，分别称为BCKDHA、BCKDHB。只要其中一种组件发生异常就可使BCKDH复合体功能发生障碍。BCKDH复合体的活性由2种调节酶对BCKDHA 293位点的可逆磷酸化和去磷酸化调控。去磷酸化激活BCKDH，催化BCAA分解；而磷酸化过程则失活BCKDH[, ]。缺乏BCKDH导致BCAA及其代谢产物在体内聚集，进而降低丙酮酸和脂肪酸的运输和利用[]。BCAA浓度的升高可促进糖原合成，严重时可导致高血糖[]。BCAA代谢异常可使2型糖尿病的发病率增加5倍[]，因而与胰岛素抵抗密切相关[]。可见，BCKDHA对于能量代谢至关重要。

BCKDHA由BCKDHA基因编码。人、小鼠和牛等物种该基因的编码序列已在NCBI数据库中公布。已有的研究表明，人BCKDHA基因的低表达会引起BCAA代谢异常，并对神经系统造成一定伤害[]。在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，BCKDHA的表达受能量水平的影响和调控[]。基因的表达受miRNA的调控已是不争的事实，而且大量的研究已证实miRNA与功能基因之间存在靶标关系。然而，BCKDHA的miRNA调控机制尚未见报道。

本研究旨在对BCKDHA基因的候选miRNA进行预测，并根据在体外培养脂肪细胞中的表达量，在细胞水平上验证二者间的靶标关系，以解析BCKDHA基因及其调节miRNA在脂肪细胞分化中的作用机理。

1 材料与方法 1.1 3T3-L1细胞培养

3T3-L1与293T细胞在37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养。所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(山西赛奥巴西vs瑞士让球有限公司)。

3T3-L1细胞的分化诱导也在同样环境的培养箱中进行。所用培养基是在上述培养基中加入终浓度分别为5 μg·mL-1、1 μmol·L-1和0.5 mmol·L-1的Insulin、DEX和IBMX储存液。

1.2 miRNA生物信息学预测及靶基因引物设计

利用TargetScan[]、miRanda[]和DIANA-microT[]共3个在线软件，预测与BCKDHA基因具有一定靶标关系的miRNAs。其中，在DIANA-microT的高级选项中将评分阈值设为0.6。用Venny2.0.2 []在线软件对3个靶基因预测软件得出的结果做韦恩图，进一步聚焦调节BCKDHA的miRNAs。

根据NCBI数据库中小鼠的BCKDHA mRNA序列，利用Primer3 plus软件设计小鼠BCKDHA编码区(Coding sequence, CDS)荧光定量的PCR引物，选用18S rRNA和β-actin基因为内参基因。miRNA的引物采用手动设计，以U6为内参基因。所有引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列见。

表 1(Table 1)

表 1 实时荧光定量PCR和载体构建所用引物序列及内参引物序列 Table 1 Primer sequences for qPCR, plasmid constructing and reference genes

基因名称Gene 引物序列(5′-3′) Primer sequence
BCKDHA-3′UTR F: CCGCTCGAGCGGATTGCTGCGGCTACTTCACT
R: CTAGTCTAGACTAGTCTCCTCCTCTCCACATACACA
BCKDHA-CDS F: CCAACCGGATTGTGATCTGT
R: GATGGCATAGCCATTGTTCC
β-actin F: CAGCCTTCCTTCTTGGGTAT
R: TGGCATAGAGGTCTTTACGG
18S rRNA F: CAGACAAATCACTCCACCAA
R: GAAGGGCACCACCAGGAGT
miR-194-5p F: ACACTCCAGCTGGGTGTAACAGCAACTCCA
R: CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCACATG
内参基因U6 Reference gene U6 F: CTCGCTTCGGCAGCACA
R: AACGCTTCACGAATTTGCGT
统一反向引物Unified reverse primer TGGTGTCGTGGAGTCG
F.上游引物；R.下游引物。下划线序列为Xho Ⅰ、Xba Ⅰ酶切位点，粗体序列为保护碱基
F. Forward primer; R. Reverse primer. The underlined sequences are Xho Ⅰ and Xba Ⅰ restriction sites; Bold sequences are protection bases

表 1 实时荧光定量PCR和载体构建所用引物序列及内参引物序列 Table 1 Primer sequences for qPCR, plasmid constructing and reference genes

1.3 总RNA的提取