过表达对重组酿酒酵母纤维素酶生产的影响

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有生长速度快、易于培养、可进行蛋白翻译后修饰和可将蛋白分泌到培养基等优势，其作为异源表达宿主在药用蛋白、工业酶等高附加值异源蛋白生产应用中的研究受到普遍关注[-]。然而，由于酿酒酵母蛋白分泌水平较低，限制了实际应用[]。为了提高酿酒酵母异源蛋白生产水平，目前所采用的策略主要包括两大类，一是提高异源蛋白表达量，二是增强异源蛋白分泌途径。提高异源蛋白表达量可通过筛选合适来源的基因、优化异源蛋白密码子、提高基因拷贝数等方式实现[]。异源蛋白的分泌包括蛋白的翻译后修饰、蛋白转运、内质网折叠和囊泡运输过程。对分泌途径各环节的关键基因进行过表达或敲除可以提高蛋白的分泌效率[-]，包括优化信号肽序列[]、激活未折叠蛋白反应(Unfolded protein response，UPR)[]、过表达蛋白质折叠相关的二硫键异构酶Pdi1p等[]。但目前对酿酒酵母分泌生产异源蛋白的调控机制了解相对较少。

酿酒酵母异源蛋白生产导致的底物竞争会直接影响胞内的相关代谢过程，或者间接地影响其他代谢过程。因此，代谢网络的全局平衡调控可以有效提高异源蛋白的生产。例如，紫外诱变获得的α-淀粉酶高分泌菌株在全基因组转录水平的分析表明，通过改变能量代谢结构、平衡氨基酸生物合成和减弱硫胺素合成等手段可提高蛋白分泌性能[]。异源蛋白的大量合成和折叠分泌等可能对细胞代谢造成一定负担，产生代谢胁迫。南非学者的研究表明，超氧化物歧化酶基因SOD1过表达可提高重组酿酒酵母纤维素酶的生产[]。此外，有研究显示，与细胞胁迫相关的热激响应(Heat shock response，HSR)的激活能够提高酿酒酵母异源α-淀粉酶的生产[]。因此，研究与环境胁迫响应相关基因对蛋白分泌的影响，有利于从全局水平提高异源蛋白生产效率。但目前通过调控全局代谢网络来提高重组酵母分泌蛋白生产的研究还很少。对影响酿酒酵母蛋白生产的新基因进行挖掘，不仅有利于发现异源蛋白生产的调控机理，还有助于开发更有效的策略提高异源蛋白的分泌生产。

在酿酒酵母中，MHF组蛋白折叠复合体组分Mhf1p与FANCM直系同源物在相同的途径中发挥作用，修复由DNA损伤剂甲磺酸甲酯(MMS)引起的DNA损伤，并在阻断的复制叉中促进基因转换，保护基因组的完整性[]。此外，其与Mhf2p形成一个类似组蛋白(H3-H4)2异四聚体结构的MHF复合物，这种四聚体的结构在发挥生物学功能中扮演着十分重要的作用[]。MHF1编码产物维护基因组完整性表明其对细胞全局代谢具有一定调控作用，有可能对重组酵母蛋白生产也有一定影响。研究MHF1过表达对重组酵母异源蛋白生产的影响，并进一步探讨其提高产酶的分子机理，可为深入研究酿酒酵母异源蛋白表达的调控机理和提高异源蛋白产量提供借鉴。

1 材料与方法 1.1 菌种和培养基

实验中使用的酿酒酵母菌株及来源见。重组酿酒酵母出发菌株Y294-CBH1、Y294-EG2和Y294-BGL1分别为过表达埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)来源的外切纤维素酶CBH1、里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的内切纤维素酶EG2和扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)来源β-葡萄糖苷酶BGL1的酿酒酵母Y294菌株，由南非西开普敦大学Riaan den Haan博士提供。

表 1　本文使用的酿酒酵母菌株及质粒 Table 1　Yeast strains and plasmids used in this study

Yeast strains and plasmids Description Source
Saccharomyces cerevisiae strains
  S288C Model organism Laboratory preserve
  Y294-CBH1 CBH1 (T. emersonii CBH1) producing parental strain From Dr. Riaan den Haan
  Y294-EG2 EG2 (T. reesei EG2) producing parental strain From Dr. Riaan den Haan
  Y294-BGL1 BGL1 (S. fibuligera BGL1) producing parental strain From Dr. Riaan den Haan
  YCMHF1 Y294-CBH1 overexpressing MHF1 This study
  YEMHF1 Y294-EG2 overexpressing MHF1 This study
  YBMHF1 Y294-BGL1 overexpressing MHF1 This study
Plasmids
  Cas9-NAT Nourseothyrcin, expression of Cas9 []
  pRS42h_gRNA_20 Hygromycin B, expression of gRNA in YPRCdelta 15 []
  pHO G418, integrating vector []
  HPC-MHF1 G418, overexpression of MHF1 This study