Myocardin调控心肌H9C2细胞Ca

作者：张馨予

钙离子(Ca2+)通道参与神经、肌肉、分泌、生殖等重要的生理过程，广泛存在于机体可兴奋细胞的细胞膜上，已发现Ca2+通道基因突变可引发多种疾病[]。其中L型电压依赖性钙通道(LTCC)具有高电压激活、电导大、开放时间长,能与多种拮抗剂作用等特点，是Ca2+进入细胞内的主要通道[]。由α1、α2、β、γ、δ 5个亚单位构成，其中α1是跨膜的亲水通道，是构成LTCC的主要亚单位，是大多数药物的结合位点。编码LTCC α1亚基的基因有4种，α1 S、 α1 C、 α1 D、 α1 F。只有αlC(Cav 1．2基因)在心肌中高表达 []。

但迄今为止，有关Cav1.2转录调控机制仍然不清楚。

Myocardin 是血清应答因子(SRF)的辅助因子，通过Q-rich功能区与SRF结合然后绑定在相关基因启动子区CarG box[CC(A/T)6GG box]上形成稳定的三元络合物，进而激活心脏发育相关基因，如结构基因和应激诱导的肥厚特异性基因等[]。敲除Myocardin 的小鼠，胚胎早期E 10.5天发育迟缓并出现心包积液及心脏血管机能不全，最终导致早期胚胎致死[]；小鼠心脏过表达Myocardin，表现出心肌肥厚和心律失常，如Q-T 间隙缩短[]；成体小鼠Myocardin 仍然在心脏和血管平滑肌中特异性高度表达。心肌细胞分化功能的维持及成熟过程都需要Myocardin的参与 [-]。

Myocardin和Cav1.2在维持心脏正常结构和功能过程中都发挥着重要作用。那么Myocardin作为一种心肌细胞重要的转录因子能否调控Cav1.2，如何调控以及Myocardin调控对心肌Ca2+通道的功能会有怎样的影响，这些问题目前尚不清楚。本文围绕以上几个问题展开研究，进一步阐明心肌细胞电生理活动的分子基础，为先天性心脏病、心力衰竭、心肌肥厚等心脏相关疾病的病因学研究提供线索，并为针对其病理机制的新药开发及临床防治提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 细胞和质粒

H9C2大鼠心肌细胞系购买于武汉博士德生物工程有限公司，pMD®18-T Vector载体质粒购自TaKaRa公司；293T细胞、pcDNA3.1质粒、pGL3-Basic质粒和心肌素Myocardin质粒为天津科技大学分子生物学国家重点实验室赠送；大鼠Cav1.2启动子和Myocardin慢病毒质粒为本实验室构建并经全基因组测序确认。

1.1.2 主要试剂

质粒中量提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自AXYGEN公司；T4 DNA 连接酶、pfu DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker均购自Thermo公司；限制性内切核酸酶KpnⅠ和HindⅢ等酶购自NEB公司。荧光素酶底物luciferin购自Promega公司；Lenti-PacTM慢病毒浓缩试剂盒和Lenti-PacTM HIV 慢病毒颗粒滴度检测试剂盒购自GeneCopoeia公司；DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 实验方法 1.2.1 慢病毒包装及细胞感染

293-T细胞长至70%~80%用于转染。转染质粒：目标慢病毒质粒Ad-Myocardin 12μg、包膜蛋白VSVG 4μg和结构蛋白NRF 8μg。加48μl Turbo转染试剂，涡旋振荡混匀，室温孵育20min。转圈加入293-T细胞，37℃ 5% CO2培养箱培养6~7h换成完全培养基。继续培养72h，观察绿色荧光强度，经0.45μm微孔滤膜过滤收集病毒，－80℃保存备用。病毒浓缩后测定病毒滴度以此确定病毒包装是否成功。用包装成功的病毒感染心肌细胞系H9C2: 6cm皿H9C2心肌细胞，加约5μl慢病毒浓缩液，48h后提取RNA或蛋白质，通过qPCR或Western blotting检测过表达效果。

1.2.2 电生理膜片钳技术全细胞记录钙电流

实验在室温(22~24℃)下进行。取出感染慢病毒48h后的心肌细胞H9C2的细胞爬片于灌流槽中，放置在倒置显微镜(Nikon) 工作台上，用100% O2饱和的正常细胞灌流液灌流。灌流液成分(mmol/L)：NaCl 135、KCl 5.4、MgCl2 0.5、CaCl2 1.8、NaH2PO4 0.33、HEPES 10、Glucose 10 (pH 7.4)。利用三维电动微操纵仪(MP285，Sutter，美国) 移动玻璃微电极至细胞表面负压吸引形成高阻封接(电阻为1~1.5MΩ)，再以负压吸破细胞膜，给予一定电压刺激(－80~40mV 持续200ms)，电流信号经Ag/AgCl 电极引导，经EP10膜片钳放大器(HEKA Electronic,Lambrecht,Pfalz Germany) 放大和滤波(2kHz)，以及双激发荧光光电倍增管系统进一步放大和转换电流信号后储存在计算机，以实现全细胞记录L型钙电流。玻璃微电极由两步玻璃微电极拉制仪(PP-83，Narishige，日本) 拉制，并经热抛光。电极内液的主要成分(mmol/L)：CsCl 80、CsOH 60、天冬氨酸40、CaCl2 0.65、HEPES 5、EGTA 10、MgATP 5，其中磷酸肌酸二钠盐和TTX(pH 7.2)用于阻断钠电流。

1.2.3 Real-time PCR法检测Myocadin，Cav1.2在转录水平的表达

应用primer primer 5软件设计定量引物，检测Myocardin和Cav1.2的表达。引物序列为：

GAPDH(F-ATTCAACGGCACAGTCAAGG，R-GCAGAAGGGGCGGAGATGA)

Myocardin(F-AGCCACCAGTCAGATGCG，R-TGGCGTTGAAGAAGAGTTTG)

Cav1.2(F-GATGAAAGGTGGGATACGAA，R-CCAAGAGCAAGTTAGGAGCAA)