1基因调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

动物脂肪组织在体内发挥着重要功能，不仅通过提供能量、维持体温、保护内脏等维持内环境稳态[]，其含量的多少还影响家畜的生产性能，特别是肉品质。脂肪组织的发育和沉积取决于前体脂肪细胞的分化与生长。哺乳动物叉头状蛋白O(Forkhead box O, FoxO)是一个转录因子家族，广泛参与细胞进程，如DNA修复、细胞周期调控、抗逆性、凋亡及代谢等[]。其中，FoxO1由FoxO1基因编码，其活性受磷酸化和去磷酸化过程的调节[]，P13K/Akt和MAPK/ERK通路使FoxO1磷酸化[]，从而导致FoxO1蛋白的转录活性受到抑制[]。

miRNA对机体的正常运转发挥极为重要的调节作用，不但参与细胞分化、发育、增殖、凋亡等过程，还对器官的正常发育和肿瘤的形成起着重要作用[]。miRNA主要是与靶基因mRNA结合，在转录后水平调节基因的表达。研究显示，脂肪细胞分化与miRNA有重要的关系[]。例如，miR-130可下调PPARγ的表达，从而抑制脂肪形成[]。

miRNA可直接调节靶基因的表达，也可通过调节转录因子的活性间接影响基因表达。关于miRNA靶向调节FoxO1的机制在人类疾病研究方面报道较多。miR-96通过作用于FoxO1促进人卵巢黄素化颗粒细胞的存活和增加孕激素分泌量[]。在人工培养的一种非小细胞肝癌(Non-small cell lung cancer)细胞系A549中发现，miR-183通过抑制FoxO1基因表达，促进A549细胞生长[]。miR-153可下调FoxO1和PTEN的表达促进正常前列腺细胞增殖，进而抑制癌细胞增殖[]。miR-374可下调FoxO1的表达促进人骨肉瘤细胞的增殖[]。这些例子说明FoxO1可以通过调节不同的靶基因发挥不同的生物学功能。FoxO1的一个重要靶基因是PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)。二者结合可抑制脂肪细胞的分化，而PPARγ本身则是促进脂肪细胞分化的，说明FoxO1下调PPARγ的表达。FoxO1在脂肪细胞分化晚期呈高表达趋势[]，应该是FoxO1下调PPARγ的表达而导致的。磷酸化的FoxO1在细胞质中，当其去磷酸化后进入细胞核中靶向作用于PPARγ，使其活性降低[]。然而，脂肪细胞分化中，FoxO1的miRNA调节机制尚不清楚。

本研究拟首先利用生物信息学方法，预测与FoxO1基因具有靶标关系的miRNAs。然后在体外培养的绵羊前体脂肪细胞中验证FoxO1基因与相关miRNA的靶标关系。由此，揭示FoxO1基因在脂肪细胞分化中的miRNA调节作用，为阐明脂肪细胞分化的网络调控机制提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验材料

本研究所用试验动物为1只出生1周内的小尾寒羊羔羊。将其屠宰后，迅速采集其皮下脂肪组织。一部分用酒精消毒后放入无菌PBS中带回实验室，用于细胞培养；另一部分装入无RNase的离心管中，置-80 ℃冰箱保存，用于总RNA的提取。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶Xho Ⅰ和Sal Ⅰ、DNA胶纯化试剂盒、T4连接酶、RNAiso Plus、SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒和PrimeScript® RT reagent kit反转录试剂盒均购自TaKaRa公司；氯仿和异丙醇购自天津市风船化学试剂科技有限公司；75%的酒精购自新泰市润生医疗卫生用品科技有限公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)粉末、Tween-20和青链霉素购自索莱宝巴西vs瑞士让球有限公司；DMEM/F-12 (HAM)、DMEM/lowGlucose和DMEM/HighGlucose 3种培养基以及胎牛血清购自Biological Industries；Trans5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒购自Promega公司；发光液购自北京康为世纪巴西vs瑞士让球有限公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶购自Sigma公司；总蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物公司；FoxO1A和羊抗兔IgG-HRP购自华安生物技术有限公司；Rabbit anti-GAPDH (AB-P-R 001)购自杭州贤至巴西vs瑞士让球有限公司。

1.2 方法 1.2.1 与FoxO1具有靶标关系的miRNA生物信息学预测

利用TargetScan[]、PITA[]、StarBase[]、miRanda[] 4个在线软件，预测与FoxO1基因具有靶标关系的miRNAs。用Venny2.1[]在线软件对4个靶基因预测软件得出的结果做韦恩图取交集，以聚焦调节FoxO1的miRNAs。各个软件的功能及其网址见。

表 1(Table 1)

表 1 生物信息学在线软件 Table 1 Online bioinformatics softwares used in this study

软件Software 功能Function 网址Website
TargetScan 预测miRNA靶基因
PITA 预测miRNA靶基因 https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.html
StarBase 预测miRNA靶基因
miRanda 预测miRNA靶基因
Venny2.1 制作韦恩图

表 1 生物信息学在线软件 Table 1 Online bioinformatics softwares used in this study

1.2.2 引物设计与合成