过表达长链鞘氨醇激酶基因
纤维素燃料乙醇是替代化石资源的可持续能源之一，与淀粉质或糖质原料燃料乙醇生产相比，木质纤维素作为农业废弃物原料充足、成本低，因此木质纤维素乙醇成为国内外生物能源研究的热点[]。然而木质纤维素原料在预处理过程中会产生大量的有机酸类、呋喃类和酚类等副产物[-]。这些化合物通过影响酵母细胞碳代谢过程、增加细胞膜透性和破坏酶活性等途径抑制酵母生长和乙醇发酵[]。基因工程、随机诱变及代谢工程等手段选育高耐受性、高效生产乙醇的工业酿酒酵母是解决这一问题的主要方法[-]。其中DNA重组技术可以使特定的基因在酵母菌株中过表达或敲除，是生物育种简单有效的方法之一。
酿酒酵母中LCB4编码的长链鞘氨醇激酶[]，位于高尔基体和次级内体[]，与膜结构相连，调节长链鞘氨醇-1-磷酸(Sphingoid long chain base phosphates，LCBPs)的生物合成[]。在哺乳动物细胞中，LCBPs是质膜脂类代谢具有生物活性的中间代谢物，可以与G-蛋白受体偶联，参与免疫细胞运输[]。同时，LCBPs作为细胞中的第二信使，参与细胞增殖、存活、运动和细胞骨架形成[-]。在酵母中，细胞受到热激后，长链鞘氨醇(Sphingolipid long chain bases，LCBs)作为引起细胞周期阻滞的信号分子大量激增，长链鞘氨醇激酶通过将LCBs磷酸化为LCBPs，使处于细胞周期阻滞状态的热激细胞恢复正常[-]。然而，目前关于LCB4基因过表达与酿酒酵母抑制物耐受性的关系有待进一步研究。因此本文研究了LCB4基因过表达对酿酒酵母模式菌株S288C抑制物耐受性的影响，为进一步选育高抑制物耐受性乙醇发酵酵母菌株提供理论和实验技术基础。
1 材料与方法 1.1 菌种大肠杆菌DH5α，酿酒酵母模式菌株S288C (本实验室保存)。
1.2 培养基抑制物耐受性检测固体培养基：YPD固体培养基中分别添加终浓度为10 g/L乙酸、1.5 g/L糠醛和1 g/L香草醛，pH 4.5；抑制物耐受性检测液体发酵培养基：在液体发酵培养基中分别添加终浓度为10 g/L乙酸、3 g/L糠醛和2 g/L香草醛，及其混合添加，pH 4.5。其中LB、YPD、酵母种子培养基和液体发酵培养基详见文献[]。
1.3 构建重组菌株S288C-LCB4利用引物LCB4-F和引物LCB4-R (引物序列见)从酿酒酵母S288C基因组中扩增获得目的基因LCB4，该基因GenBank登录号为NM_001183590.1。将所得LCB4基因片段克隆到pHO整合表达载体[]。将验证正确的pHO-LCB4质粒经限制性内切酶NotⅠ线性化后回收目的条带，通过电转化法将LCB4基因同源整合到宿主酵母S288C染色体HO位点[]。通过含G418抗生素(固体培养基添加300 μg/mL，液体培养基添加100 μg/mL)的YPD培养基筛选，并经富集培养后提取基因组作为模板，利用验证引物LCB4-F和PG418-R进行PCR初步验证。
表 1 本文所用引物列表 Table 1 Primers used in this study
Primer name
Primer sequence (5'-3')
LCB4-F
AAACCCGGGATGGTGGTGCAGAAAAAACTT
LCB4-R
CCCTTAATTAACTACATGGATTCAAACTCT
PG418-R
GGCCTCGAAACGTGAGTC
rtLCB4-F
CAAACTCTTCGCCGGATTTA
rtLCB4-R
AGGTACTGGTTCCGTCATCG
rtALG9-F
ATCGTGAAATTGCAGGCAGCTTGG
rtALG9-R
CATGGCAACGGCAGAAGGCAATAA
将含有空载体的对照菌株S288C-HO及重组菌株S288C-LCB4接种至种子培养基中进行活化，30 ℃、150 r/min条件下培养至对数期进行下一步实验。
1.4.2 重组菌株的耐受性检测将活化后的菌液OD620调至一致(1.0)，以5倍梯度稀释为6个浓度，依次取2 μL菌液点样于抑制物耐受性检测平板，30 ℃倒置培养24-36 h，观察培养过程中菌株生长状况并拍照，具体方法参见文献[]。
1.4.3 抑制物胁迫下的乙醇发酵比较对照菌株S288C-HO和重组菌株S288C- LCB4分别在抑制物单一和共同添加下的乙醇发酵性能。发酵方法如下：菌株经活化后用种子培养基调节OD620至1.0，按接种量10% (V/V)接种到含90 mL抑制物耐受性检测发酵培养基的250 mL摇瓶中，30 ℃、150 r/min条件下进行发酵实验。每隔6-12 h定时取样，测定发酵液菌体、残糖和乙醇浓度，每组进行3个平行实验。
1.5 发酵参数及代谢物的测定上一篇：肝细胞癌中的作用及其机制
下一篇：《果树学报》2012年06期