1基因CDS区克隆及其对颗粒细胞增殖和凋亡的影响
转录因子特殊蛋白因子1(Sp1)属于SP/Kruppel样转录因子(Sp-like and Kruppel-like transcription factors, Sp/KLFS)家族，且是该家族第1个被发现的转录因子[]。Sp1蛋白主要包含4个部分：DNA结合区域、Sp1活化区、Btd盒及Sp盒，在Sp1C端3个串联的Cys2His2型锌指结构域能够特异性识别GC盒(-GGGGCGGGG-)与GT盒(-GGTGTGGG-)，从而参与基因的转录调控[]。因为在许多看家基因的启动子区都有Sp1结合位点，所以Sp1基因通常作为组成型转录因子调节启动子活性。同时也有研究表明，Sp1参与组织特异性基因的表达调控，转录因子Sp1启动猪ROCK1基因的表达[]；Sp1作为转录激活剂调控成纤维细胞生长因子的表达[]；Sp1转录因子启动TMEPA1基因表达并促进细胞的增殖[]。
Sp1表达上调激活Wnt/β-Catenin信号通路促进细胞的增殖[]。最近研究表明，Sp1还具有促凋亡的作用。在结肠癌SW480-细胞中，Sp1可通过调控人端粒酶反转录酶基因调节端粒酶的活性而使细胞凋亡[]。在肝癌的研究中发现，Sp1通过上调NF-DR5κB的转录活性而诱导肝癌细胞凋亡[]。有些抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-x、Survivin)和促凋亡基因(Bax、Trail、Fas、Caspase-8和Caspase-3)的启动子区均发现存在Sp1转录因子结合位点[]。尽管Sp1具有抑制增殖、促进凋亡作用，但Sp1对颗粒细胞调控还未见报道。本试验以湖羊卵巢组织为研究对象，扩增Sp1基因编码区全序列，分析其序列特征，构建真核表达载体转染人颗粒细胞系KGN-细胞，研究湖羊Sp1基因在KGN-细胞中的功能，为进一步解析Sp1基因在湖羊卵泡发育中的作用提供一定的依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物试验湖羊来自江苏省泰州市西来源有限公司，母羊屠宰后收集心、肝、脾、肺、肾、子宫和卵巢组织于液氮中保存备用。采用试剂盒(百迈克，中国)提取RNA，并使用Prime Script TM-RT RTM Mix完成cDNA第一链的合成(TaKaRa，日本)。
1.2 引物的合成和扩增根据绵羊Sp1基因序列(序列号：XM_012174189.2)，采用Primer Premier 5.0软件设计3对特异性引物P1、P2和P3，用于湖羊Sp1编码区的扩增、表达载体构建及湖羊组织表达模式的鉴定。引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成，引物序列的相关信息见。
表 1(Table 1)
表 1 Sp1基因扩增引物 Table 1 Primer used for amplification of the Sp1 gene
引物
Primer
基因
Gene
引物序列(5′-3′)
Primer sequence
退火温度/℃
Tm
产物长度/bp
Product size
用途
Application
P1
Sp1
F: ATAGGTACCCGCCGACCCTCGTATTTC
R: ATACTCGAGCGCGTCTCTTGGACCCAT
58
2 615
CDS扩增及表达载体构建
P2
Sp1
F: GCTATGCCAAACCTACTCC
R: CTGAAGCCCACTGACCCT
56
411
Real-time PCR
P3
GAPDH
F: ACTTTGGCATCGTGGAGG
R: GAAGAGTGAGTGTCGCTGTTG
58
379
Real-time PCR
下划线为酶切位点
Underlined for the digestion site
以湖羊卵巢组织为模板，扩增湖羊Sp1基因编码区序列。PCR反应体系为25 μL，含模板DNA 60 ng、1.5 TM2X High-Fidelity Master Mix 5 μL、上下游引物各1 μL，添加灭菌双蒸水至25 μL。PCR扩增程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，53 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。
1.3 序列分析与系统发育树的构建用DNAMAN6.0软件进行序列翻译并与其它动物的核苷酸和氨基酸序列进行比对。在NCBI的ORF Finder()中进行开放阅读框的预测，利用DNAStar软件对从GenBank中挑选6个不同动物的Sp1所编码的氨基酸序列进行多序列比对分析()，用MEGA5.1软件包中的邻接法NJ构建系统发育树。
表 2(Table 2)
表 2 不同哺乳动物Sp1氨基酸序列信息
Table 2 The amino acid sequences information of Sp1 in different mammals
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