四链体核酸序列多态性与表达调控功能研究

作者：张馨予

G-四链体(G-quadruplex，G4)是由富含鸟嘌呤(guanine，G)的核酸序列经折叠堆积所形成的四链体螺旋结构。如所示，G-四分体(G-tetrad)作为G-四链体的结构单元，是由Hoogsteen氢键连接其中的4个G形成的环状平面，两层或以上的G-四分体通过π-π碱基堆积作用力形成G-四链体[]。能够形成G4的DNA序列一般具有以下特征：G3-5NxG3-5NxG3-5NxG3-5，其中G3-5代表 3~5个G的串联重复序列(形成G-tract)，Nx代表由1~7个任一碱基组成的间隔序列(形成loop区域)。G4结构可通过圆二色谱等技术进行体外检测[]。Lam等利用G4 DNA抗体hf2在癌细胞中分离并检测到G4[]，证明G4在人基因组中稳定存在。近期研究发现，G4广泛分布于端粒、启动子区域等具有重要功能的基因组区域，在外显子、内含子、3’非编码区也有G4存在。研究提示，G4结构具有重要的生物学功能，如调控基因表达、影响基因组稳定性、维持端粒长度等[]。

四链体核酸序列多态性与表达调控功能研究

G-quadruplex structures are based on the stacking of several G-tetrads, which consist each of four guanine bases held together by Hoogsteen-hydrogen bonding, stabilized in the presence of cations (M+) in the central channel of the G4. The sequence motif is G3-5NxG3-5NxG3-5NxG3-5. A G4 motif consists of four runs of at least three guanines (G-tract) per run and separated by other 1-7 bases (Nx). 图 1 G-四链体示意图 Fig. 1 Schematic of a G-quadruplex

牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M. bovis)与卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株基因组序列的最大不同是后者出现大的基因组片段丢失，其中RD1区域(包含ESX-1分泌系统的编码基因Rv3871~Rv3879c)缺失是导致BCG毒力丢失的主要原因之一[]。espK基因是RD1区域的9个基因之一，编码的EspK蛋白全长729个氨基酸，富含丙氨酸和脯氨酸，是ESX-1分泌系统组分之一。研究表明，EspK与EspB的分泌有关，是构成结核分枝杆菌Ⅶ型分泌系统的重要蛋白元件。Inwald等比较牛分枝杆菌与结核分枝杆菌H37Rv的EspK同源蛋白序列时，发现GTPITP氨基酸序列的串联重复多态性[]。本研究结果显示，EspK中GTPITP氨基酸重复序列由CCCC串联重复的间隔核酸序列编码，其模板链上存在G4特征的核酸序列；该G4序列仅存在于结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)；结核分枝杆菌临床分离株中espK的G4序列存在高频率的点突变；圆二色谱检测证明该片段核酸能在体外形成G4结构；进一步研究发现，该G4多态性与结核分枝杆菌espK基因表达调控有关。

1 材料与方法 1.1 菌株和质粒

结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、质粒pMV306和质粒pMV361为本实验室储存。

1.2 主要试剂和仪器

Middlebrook 7H9、7H11培养基购自美国BD公司，FLAG-tag Mouse mAb、Hsp65 Mouse mAb、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠IgG购自Sigma公司，胶回收试剂盒、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)产物回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、RNA纯化试剂盒购自Thermo Scientific公司，Maxima H Minus First Strand cDNA合成试剂盒购自Invitrogen公司，TRIzol、SYBR® Premix Ex Taq GC购自TaKaRa公司。

1.3 细菌培养

大肠埃希菌采用LB培养基，37 ℃培养。耻垢分枝杆菌采用Middlebrook 7H9液体培养基和Middlebrook 7H11固体培养基，37 ℃培养。卡那霉素含量为20 μg/mL。

1.4 G4核酸序列

espK G4核酸序列(espK WTG4)为TGGGG-TTCCCGGGGTGATCGGGGTTCCCGGGGTGA-TCGGGGT(下划线部分为G-tract)。通过引入同义突变(将加粗斜体的G替换为C)，构建含有同义突变的espK G4核酸序列(espK MutG4)。结核分枝杆菌临床分离株中的espK G1573C突变的G4核酸序列(espK G1573C mutG4)为TGGGGTTC-CCGGGGTGATCGGGGTTCCCGGGGTGATC-GGGGT(下划线部分为G-tract，加粗斜体的C为G>C突变碱基)。

1.5 圆二色谱法检测G4

将espK WTG4、espK MutG4和espK G1573C mutG4核酸片段用Buffer K+(1 mmol/L K3PO4，0.3 mmol/L EDTA，100 mmol/L KCl，pH 7.0)溶解至终浓度为50 μmol/L。然后在PCR仪上进行循环降温(90 ℃ 10 min预热后，每分钟下降0.5 ℃直至4 ℃)，置于冰上。利用Jasco-810分光偏振器测定寡核苷酸样品的圆二色谱。使用1 cm宽的石英微量比色皿，扫描范围200~320 nm，扫描速率为100 nm/min。其他参数为：1 nm倾斜度(pitch)，1 nm谱带宽度(band width)。先用Buffer K+调零后，然后检测待测核酸样品，同时测量样品熔解温度(melting temperature，Tm)。

1.6 含有G4突变体的espK表达菌株构建