如何选择合适的qRT-PCR内参基因？

作者：杨超月

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)作为一种检测mRNA的敏感方法已被广泛应用于基因的表达分析。与常规PCR相比，qRT-PCR具有精确性好、敏感性高、支持批量检测及适用广泛等优点。在利用qRT-PCR技术检测目的基因的表达水平时。为了减少检测样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差异，需要选择合适的稳定内参基因作为校正标准，但是迄今为止尚未找到在所有条件下均可稳定表达的内参基因。近年来出现了筛选稳定性好的内参基因的新方法，如使用GeNorm软件、基因芯片据、EST数据库。

1.qRT-PCR中内参基因的意义

内参基因是指其表达水平不受研究条件的影响且可以在多种样本间恒定表达的已知参照基因。用这个基因的表达水平可以准确量化初始材料的载量。由于管家基因的表达水平受环境因素影响较小，并能在生物体几乎全部组织及各个生长阶段持续表达，所以在试验中通常选用管家基因作为内参基因，然而，管家基因在部分不同组织或不同处理条件下其转录水平可能会发生变化，所以，迄今为止尚未找到理想的内参基因。目前进行qRT-PCR定量基因表达的方法主要有两类，即绝对定量法和相对定量法。

绝对定量法能够获得基因表达的准确表达量。但针对不同的目的基因，需要构建不同的标准品，大大增加试验的难度和复杂性。因此，利用qRT-PCR技术测定基因的表达量时。往往不是直接测定目的基因的绝对表达量，而是分别测定目的基因和内参基因的表达量。并把内参基因的表达量作为一个标准来测出目的基因的相对表达量，最后再进行样品间相对表达量的比较。与绝对定量法相比相对定量法简单、准确并且高效，应用十分广泛，但其需要选择合适的内参基因。

在用相对定量法测定基因的表达水平时，还需要考虑数据如何呈现。qRT-PCR得到的CT值是指数关系，不是线性关系，因此不能将CT值直接用于需要数据正态分布的统计分析方法如t检验和方差分析(ANOVA)方法中，所以统计数据时应先将原始CT值进行2-CT转换，使数据达到线性关系后再进行统计分析。在用相对定量法得到数据后，进行数据分析时常用比较CT值法(2-△△CT法)。此方法基于2个假设：①扩增效率为100％，即每个PCR循环产物的量都翻倍，可以通过扩增效率的验证来解决；②有合适的内参基因校正上样量的误差。

2.内参基因在物种及组织的表达特异性

内参基因通常是各种管家基因，各类管家基因在生物体各类细胞中都表达。然而，在不同的物种及不同类型的组织中管家基因的表达也具有特异性。已有的研究结果表明，在所有组织、发育时期、生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在，所以其表达的稳定性是相对的(表1)，需要研究者根据自己的样品类型及试验条件来选择合适的内参基因。

表1 已报道的部分物种qRT-PCR内参基因

3.常用内参基因的缺陷

很多qRT-PCR试验只选择单一的内参基因来校正与标准化目的基因的表达，其中常用内参基因有GAPDH，β-actin、18S rRNA和28S rRNA等。

3.1 GAPDH

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是糖酵解、糖异生及光合作用过程中碳固定循环中的关键酶，是最常用的内参基因之一。但是，许多研究表明GAPDH在某些特定条件下其表达存在不稳定性。如Robert等人根据GAPDH在人类72个不同组织中的表达研究，结果显示GAPDH表达量最高的骨骼肌组织相对于表达量最低的乳房组织，其表达量竟相差了15倍。Glare等人利用qRT-PCR技术检测GAPDH在支气管肺泡灌洗回收液里的细胞和支气管内膜活检组织中的表达时，发现其在支气管患者组织的表达量低于正常人组织的表达量。因此，GAPDH在上述条件下作为内参基因遭到质疑。

3.2 β-actin

β-actin是肌动蛋白的一种，存在于所有真核细胞中且高度保守，因此常被作为内参基因广泛使用。Nygard等人应用荧光染料实时定量PCR方法研究不同基因在猪的不同组织表达水平的稳定性时，发现β-actin稳定表达。然而，在一些特定组织及试验条件下，β-actin表达量同样很不稳定。如Glare等人发现在哮*气道内β-actin表达不稳定；Bas等人利用qRT-PCR技术分析常用内参基因在人类T淋巴细胞中的表达稳定性试验中，研究结果也表明β-actin不适合作为内参基因。

3.3 18S rRNA和28S rRNA