基于实时荧光定量PCR的大豆内参基因筛选

作者：杨超月

【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr)作为我国重要粮食作物,已有5000多年的栽培历史。对于大豆的研究从很早就开始,近年来随着生物技术的发展从分子生物学水平研究大豆逐渐成为大豆科学研究的主要趋势。从基因表达调控来研究大豆生理生化过程,对于大豆的种质改良有重要的意义。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)作为精确核酸定量的重要试验方法,广泛应用于基因表达研究中。而内参基因(Reference gene,RG)作为模板丰度的参照在很大程度上影响到目的基因表达的准确度。本研究拟用5个传统内参基因ACT11,GAPDH,TUB4,EF1A,CYP2;5个不同方法筛选出的新型内参MTP,MTP1, CDPKK,ABCT,UKN2 。作为候选内参基因,部分引物来自已发表的文献,部分引物自己设计。引物测试结果发现MTP有错配,ABCT出现双熔解峰。将初步筛选后的8个候选内参基因进行后续试验。用RT-qPCR的方法对大豆种子发育及萌发过程中：种子、子叶、胚轴；营养器官：根,茎,叶；逆境条件：干旱胁迫、高温胁迫的材料做了内参基因表达检测,通过geNorm,NormFinder,BestKeeper三个程序综合分析,最后筛选出不同环境、不同组织中的最适内参基因或内参组合。结果如下：1)在种子发育及萌发整个过程中推荐CYP2,GAPDH,CDPKK联合使用;而在种子发育过程中CYP2和GAPDH表达最为稳定；子叶中ACT11和CYP2表达稳定性最好;胚轴中UKN2和TUB4表达稳定性最好。2)综合分析营养器官中推荐EF1A,CYP2,ACT11联合使用;在单独分析根时推荐ACT11,CDPKK和UB4联合使用;在茎中TUB4和CYP2为最适内参基因；在叶片中最适内参基因为CYP2,UKN2及MTP1。3)逆境胁迫下综合考虑用UKN2,TUB4及EF1A来标准化转录本。干旱胁迫下推荐EF1A,CYP2及TUB4联合使用,高温条件下UKN2和TUB4表现最好。4)所有供试材料中并不能准确的筛选出一个或一组表达稳定的内参基因,结合前人的研究可能CYP2和ACT11的联合使用可以提高RT-qPCR结果的准确度。