乙酰氨基半乳糖转移酶2的基因表达及转录动态分

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

O-糖基化(O-linked glycosylation)修饰是蛋白质翻译后糖基化的主要形式，发生于真核生物的Golgi体，也存在于细菌和古细菌[-]。其反应过程是在糖基转移酶(glycosyltransferase)家族不同酶催化下，将参与反应的各种糖链，如O-N-乙酰半乳糖胺(O-N-acetylgalactosamine, O-GalNAc)、O-岩藻糖(O-fucose)、O-葡萄糖(O-glucose)、O-N-乙酰葡糖胺(O-N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)和O-甘露糖(O-mannose)等，转移到多肽链的丝、苏、酪、羟脯氨酸等残基上[]，是保证细胞内相关功能蛋白质正确折叠、维持结构稳定性和亲水性、发挥功能(如细胞黏附、配体识别等)所必须的生化过程，也是病原体的重要毒力因子或致病分子，如普遍存在于细菌的O-GlcNAc和锥虫、利什曼原虫等的O-甘露糖化[, ]。在真核生物，O-GalNAc糖基化修饰化最为普遍，是在多肽:N-乙酰半乳糖氨基转移酶(UDP-N-acetyl-D-galactosamine:polypeptide N-acetylgalactosaminyl-transferases, EC 2.4.1.41, ppGalNAc-Ts)的催化下将O-GalNAc转移到蛋白质分子中的丝氨酸或苏氨酸残基上[]。该酶是黏蛋白O-糖基化反应途径的起始酶，在绝大数已研究过的物种都存在2个以上的基因所编码的ppGalNAc-Ts同种型(isoform)，如人类有20个，啮齿动物19个，果蝇14个，C. elegans有9个同种型[-]，这些同种型不仅其表达随发育阶段和组织分布有所差异，且在一级结构和空间构象上也有所差异，但在一级结构上都具有短的跨膜结构域、茎区、Gal/GalNAc结合区(包括GT1和Gal/GalNAc-T 2个模体)、Mn2+结合位点以及蓖麻毒蛋白样凝集素结构域的共同特征；各同种型催化GalNAc残基转移的酶动力学特征具有显著差异[]，使O-糖基化修饰成为真核生物中最丰富的糖基化形式，并由此而赋予O-糖基化反应在组织和细胞中巨大的差异调节潜能，成为抗肿瘤药物、抗感染药物、人工合成抗体等的重要靶标分子[]。

艾美耳球虫(Eimeria spp.)是兽医学上最重要的病原体之一，可导致禽、兔、猪、牛、羊等养殖业生产的重大经济损失。据估计，球虫病每年可给全球养鸡业造成30亿美元以上的经济损失[]；而在我国，养鸡业因球虫病的经济损失高达60亿~70亿元，仅药物支出一项就高达12亿元以上[]。现今，临床上鸡球虫病仍主要以药物防治为主，但鸡球虫对抗球虫药物的严重抗性及人们对动物性食品药物残留问题的日益关注[-]，迫切需要发现新的药靶和新型高效药物。ppGalNAc-Ts与其他代谢关键酶一样，作为病原体生存所必需分子及与其宿主同源物在结构或生化特性方面的显著差异而成为理想的药靶分子[]。尽管基因组数据揭示球虫存在糖基化修饰代谢途径，但对其蛋白质糖基化修饰谱及其酶类的研究迄今尚鲜见报道。为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)O-糖基化修饰对球虫发育的表观遗传调控效应及其酶类的药靶效应(druggable target)，根据EuPathDB数据库中的预测基因序列，进行了EtppGalNAc-T2的基因克隆表达及其不同发育阶段的相对表达动态分析，为进一步研究球虫的O-GalNAc化修饰建立实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 虫株

E. tenella广东株，本实验室分离、保存。

1.1.2 菌株与质粒

克隆载体pMD-19 T Vector、E. coli Trans5α和E. coli Transetta (DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；表达载体pGEX-6p-1购自Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.2 主要试剂

Premix Ex Taq聚合酶、SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA ligase、PrimerScripTM 1st Strand cDNA Synthsis Kit购自TaKaRa公司；E. Z. N. A胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒Ⅰ购自OMEGA公司；脱氧胆酸盐和胰酶购自Sigma公司；TRIzol购自Invitrogen公司。

1.3 EtppGalNAc-T2基因的克隆和测序分析 1.3.1 引物设计与合成

检索EuPathDB数据库获得EtppGalNAc-T2的基因编码序列(ETH_00029115)，以在线工具BLASTx()进行比对、确认功能注释后[]，以此序列为模板，Primer Primer 5.0设计PCR引物(EtppGalNAc-T2-F: ATggCCCCAgggAgAgCC; EtppGalNAc-T2-R: TTACATTCTTgCTTTCATgTAg)，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.3.2 E. tenella不同发育阶段总RNA的提取与基因克隆

纯化的子孢子(SZ)、第二代裂殖子(2nd MZ)、未孢子化卵囊(USO)、孢子化7 h卵囊(SO7 h)和孢子化卵囊(SO)液氮研磨后，按TRIzol试剂盒方法分别提取总RNA。提取的E. tenella 各阶段RNA用PrimerScripTM 1st Strand cDNA Synthsis Kit反转录成第一链cDNA，与设计合成的上下游引物建立PCR反应体系(Premix Ex Taq 25 μL；模板1 μL；上下游引物各1 μL；ddH2O 22 μL)，按程序“94 ℃ 4 min→35次下列循环(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s)→72 ℃ 7 min→4 ℃”进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，E. Z. N. A胶回收试剂盒回收，与克隆载体pMD-19 T于16 ℃连接过夜，转化E. coli Trans5α感受态细胞后挑取阳性克隆测序鉴定。

1.3.3 EtppGalNAc-T2编码蛋白质的序列分析