基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖

作者：张馨予

鹿茸作为哺乳动物中唯一能够完全再生的骨质性附属器官，生长极其迅速，且成骨过程极易观察。鹿茸生长顶端具有明显的真皮层、间充质层、前成软骨层、过渡层和软骨层[]，同时在生长高峰期细胞的生长速度可达到癌细胞的30倍，但其却不发生癌变[]。研究表明，鹿茸的再生是基于干细胞的过程，鹿茸干细胞具有补充维持鹿一生中每一个鹿茸再生循环所需的快速增殖细胞的能力。鹿生茸区骨膜细胞（antlerogenic periosteum，AP）为鹿茸发生的干细胞[]，而且由于其可分化成皮肤、血管、神经、软骨及骨等多种成分[]，因此，鹿茸可作为一种研究骨快速生长、成骨过程以及干细胞生物学等的天然优秀模型。

CGI99基因（同名基因C14orf166）全长1 064 bp，核心编码区738 bp，编码分子量约26 kD的蛋白分子，该基因主要表达于细胞质，但在细胞核中也有表达[]。本实验室构建的SSH（Suppression Subtractive Hybridization）文库筛选到了CGI99基因，通过原位杂交试验发现该基因在鹿茸软骨小梁中高度表达（未发表），而在鹿茸的其他部位则几乎不表达（如血管），因此，推测其在鹿茸软骨发育、成骨中具有重要的调节作用，如可能与参与软骨发生的调控[]。由于AP细胞可分化为软骨，本实验利用慢病毒介导的RNAi途径，靶向沉默AP细胞中的CGI99基因[]，并进一步探究CGI99基因沉默对AP细胞增殖的影响，旨在为继续研究该基因的相关机制做好初步工作。

1 材料与方法 1.1 材料

AP细胞、细胞株人胚肾细胞293t、载体质粒pLVTHM、包膜质粒pMD2.G、包装质粒pSPAX2均由本实验室保存；限制性内切酶Cla Ⅰ、Mlu Ⅰ 购自NEB公司；T4 DNA 连接酶、1 000 bp DNA Marker购自TaKaRa（大连）公司；感受态细胞DH5α购自全式金公司、小量质粒提取试剂盒购自Axygen公司；大量质粒DNA 提取试剂盒购自Promega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工公司；DMEM、Trypsin 购自Life Tech公司；标准胎牛血清购自Gibco公司；SYBR GREEN 、X-tremeGENE HP购自Roche公司；ploybrene购自Santa Cruz Biotech公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法 1.2.1 梅花鹿CGI99基因shRNA重组慢病毒载体的构建及鉴定

根据本课题组cDNA文库中的CGI99基因序列（数据未发表），并根据The RNAi Con- sortium（TRC）RNAi靶位点筛选法则、Angela筛选法则及通过在线设计等方法比较多条备选序列，最终选择了1条针对梅花鹿CGI99基因的高分RNAi靶序列。为确保该序列不会对梅花鹿其他基因造成影响，将靶序列在NCBI中进行同源性比对，另外在人类的基因组中进行相似的比对（包装细胞为人胚肾293t），以确保靶序列不会对包装细胞的相关基因产生RNAi效应。在RNAi序列两端加上酶切位点、终止信号、内成环结构等，送公司合成。共设计2对shRNA序列（），其中S2为无意义链，作为阴性对照。合成的序列经退火后形成双链Oligo DNA，与经Cla I、Mlu I双酶切后的pLVTHM质粒连接，经DH5α感受态细胞转化、扩增。挑选重组阳性克隆菌株，提取质粒后，按如下引物进行PCR鉴定[]：上游5'-ctgggaaatcaccataaacg-3'，下游5'-ttattcccatgcgacggtat-3'。对鉴定为阳性的质粒进行测序鉴定（博仕生物有限公司）。测序正确后大量提取质粒，同时对pSPAX2和pMD2.G两种质粒进行大量提取备用。

表 1 shRNA 序列

1.2.2 重组慢病毒包装

对293t 细胞进行实验前的处理，当293t 细胞生长状态合适时，使用1.5 mL opti-MEM 稀释10 μg DNA（pLVTHM重组阳性质粒、pSPAX2与pMD2.G的质量比为4∶4∶2），同时添加20 μL X-tremeGENE HP转染试剂，室温下孵育25 min，将该混合溶液加到细胞培养皿中，轻摇培养皿以混匀。在37℃，CO2浓度为5%的培养箱中孵育12 h后，更换为完全培养基。继续培养12 h后检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，以此确定三质粒的转染效率。收集细胞培养皿中转染24 h的培养基，并用0.45 μm滤器过滤以弃去细胞碎片沉淀，然后经100 kD 超滤管浓缩后用1.5 mL EP管分装，-80℃保存待用。

1.2.3 重组慢病毒感染AP细胞

消化并重悬AP细胞，准确计数后，添加2.5×104个细胞于6孔板中央，添加2 mL完全培养基。12 h后进行重组慢病毒感染，弃去6孔板中培养基，替换为2 mL含有200 μL（滴度3.2×106 TU/mL）慢病毒液及2 μL polybrene的混合液，12 h后更换为完全培养基，24 h后观察AP细胞荧光蛋白GFP的表达情况。

1.2.4 RT-PCR检测AP细胞RNAi效率

取感染后的AP细胞，提取总RNA，酶标仪测定RNA浓度及纯度后，反转录总RNA为cDNA，之后进行荧光定量PCR反应，选择GAPDH作为内参基因，对结果进行校正，以未做任何处理的AP细胞作对照，反应条件如下：95℃预变性10 min；94℃变性15 s，55.4℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40个循环；72℃ 5 min，4℃。

针对CGI99基因及GAPDH内参基因分别设计一对引物，见。

表 2 CGI99 基因及GAPDH 内参基因引物序列

1.2.5 MTT实验检测AP细胞增殖情况