运用iTRAQ蛋白质组学探索新型tRNA增产抗生素

作者：张馨予

　　抗生素耐药性是当今全球健康面临的最大威胁之一，解决措施之一是加快发现和生产新的抗生素。目前大约70%的抗生素来自链霉菌产生的天然产物。链霉菌的生物合成基因簇 (BGC) 编码可将初生代谢产物转化为复杂的生物活性分子（例如抗生素）。因此一个简单通用策略是增加BGC的表达，它也是新抗生素发现的基础。

　　2022年5月，中国科学院西北生态环境资源研究院刘光琇研究团队（一作：陈熙明副研究员）在Nucleic Acids Research期刊（IF:19.16）发表的题为“A new bacterial tRNA enhances antibiotic production in Streptomycesby circumventing inefﬁcient wobble base-pairing ”的研究成果，发现了一种新型tRNA，并通过iTRAQ蛋白质组学方法证实其提高链霉菌抗生素产量效果，为增产抗生素的生物路径探索提供了理论依据。中科院沙漠与沙漠化重点实验室、甘肃省极端环境微生物资源与工程重点实验室陈熙明副研究员为第一作者，刘光琇研究员与英国Swansea大学Paul Dyson教授为共同通讯作者。

　　中文标题：一种新的细菌 tRNA 通过规避低效的摆动碱基配对提高链霉菌的抗生素产量

　　研究对象：链霉菌

　　发表期刊：Nucleic Acids Research

　　影响因子：19.16

　　发表时间：2022年5月30日

　　运用生物技术：iTRAQ蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)

　　研究背景

　　本文作者对从中国西北沙漠中分离出来的快速生长 S. violaceusniger 菌株 SPC6（称为 SPC6）的 6.5 Mb 小基因组进行了测序，并描述了在 SPC6 基因组中发现的新型 tRNA-Asp-AUC功能。作者展示了它在一系列链霉菌中的异源表达如何促进抗生素的早熟和增产，揭示了一种基于 GAT 密码子翻译效率的基因表达调控新方式，以及影响抗生素生物合成的方式。

　　研究思路

　　研究方法

　　1. 实验分组/研究材料

　　（1）本研究中使用的链霉菌属物种和菌株列于表 1。

　　（2）克隆中间体：大肠杆菌 JM109 (14) 。

　　（3）质粒与链霉菌属的属间缀合的供体：大肠杆菌 ET12567 (15) 。

　　2.技术路线

　　2.1. 菌株RNA纯化、测序和qRT-PCR分析，eGFP表达分析

　　2.2.iTRAQ 蛋白质组学分析

　　2.3.抗生素和钴胺素的定量分析

　　表1 实验涉及的链霉菌

　　研究结果

　　1. 一种新 tRNA-Asp-AUC 的细菌结构、功能和基因组信息

　　对 SPC6 的 tRNA 补体的分析揭示了编码 44 个不同物种的 75 个 tRNA 基因。该补体包括一个可能的具有反密码子序列 AUC 的 tRNA-Asp。该 tRNA-Asp-AUC 的 Cove 评分（二级结构稳定性和因此功能的预测因子）为 29.08，反密码子环的茎由 3 个 G:C 碱基对稳定（图1A）。在3tRNA 数据库、GtRNAdb、tRNADB-CE和 tRNAdb 数据库进行搜索，仅在五个细菌基因组中揭示了潜在的 tRNA-Asp-AUC，这些潜在 tRNA 物种的功能没有被分析，并且它们与 SPC6 tRNA-Asp-AUC 没有显著同源性。

　　作者还用6个GAT密码子在天蓝色链球菌菌株中表达修饰的 eGFP 基因，该菌株也表达 tRNA-Asp-AUC，其天然启动子整合到染色体中。在该菌株中观察到荧光营养菌丝，表明 eGFP mRNA 在早期生长阶段的有效翻译（图1D），结果证实了在没有同源 tRNA 的情况下，依赖于摆动碱基配对的 GAU 密码子的翻译在营养生长期间效率低下。这些实验证实了预测的 tRNA-Asp-AUC 确实有效地解码了 GAT 密码子。

　　图1 | tRNA-Asp-AUC的结构和功能分析

　　2.tRNA-Asp-AUC 影响异源模型链霉菌、天蓝色链霉菌中的基因表达

　　作者预测 tRNA-Asp-AUC 的表达可以导致由带有 GAT 密码子的基因编码的蛋白质更有效地翻译。事实上，在营养琼脂上生长后，在 3 天和 5 天两个时间点，将有和没有 tRNA 的天蓝色链霉菌菌株的iTRAQ蛋白质组学结果进行比较，具有显著差异。例如，在第 3 天过表达的蛋白质中，有几个是具有一个或多个 GAT 密码子的转录调节因子（例如 SCO2015、SCO223、SCO2517、SCO4628、SCO4677、SCO6286 和 SCO7146）。值得注意的是，就生物学功能而言，它们是由两种抗生素 BGC 编码的蛋白质。