Paque单个核细胞分离方法

作者：杨超月

基于Ficoll-Paque产品的细胞分离可在宽泛的血液样品体积中进行。由于其高产率，该方法可适用于处理极少量的血液，例如从儿童获得的样品。为了获得高分离可重复性，建议使用标准化操作步骤。以下操作步骤通过了我们的实验室使用Ficoll-Paque PLUS的评估并建议用于正常血液样本的分离，经过简单的更改即可适应特定的离心系统。该步骤也非常适合采用Ficoll-Paque PREMIUM、Ficoll-Paque PREMIUM 1.084以及Ficoll-Paque PREMIUM 1.073进行细胞分离。

为了建立标准化步骤，应先选择离心管的血容量和直径。这些因素决定了血液样本在管中的高度，进而决定了离心时间。增加管中血样的高度会增加红细胞的污染。然而分离却不会因为管直径的改变而受到明显影响。因此，在管中血样的高度和分离时间保持不变的情况下，管径越大，相同的纯化程度下分离体积就越大。

单核细胞的产量和纯化程度很大程度取决于红细胞的去除效率。

当全血中的红细胞发生聚集时，一些单核细胞会被捕获在团块中而与红细胞一同沉淀。这种单核细胞捕获的倾向性可通过稀释血液来减少。稀释有利于提高单核细胞产量并降低红细胞团块的大小。红细胞的聚集在较高温度（37℃）下会增强，从而会降低单核细胞的产量。然而在较低温度（4°C）下，聚集速率减低但会增加分离时间，这也会使得单核细胞的产量发生降低。折衷温度在18ºC至20°C中间可获得最佳效果。

自备设备和溶液

无菌平衡盐溶液或其他标准盐溶液（参考试剂制备部分）

带有水平转子的离心机（应关闭制动）

无菌离心管和移液器

无菌针头和注射器

相应选择的红细胞裂解液（如果分离粒细胞）

试剂制备

稀释及洗涤液

用于血液稀释和细胞洗涤的平衡盐溶液可按照以下指南进行制备。其他的稀释液和洗涤液如等压无Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲液（如Dulbecco’s PBS）、盐溶液（如Hank’s）或细胞培养培养基（如RPMI 1640）也可使用。

平衡盐溶液
在进行平衡盐溶液制备是，将一份体积的储存液A与九份体积的储存液B混合后进行灭菌。至少20 ml的每个样本需要被处理。可能也会用到其他无菌的标准盐溶液。

溶液A

浓度(g/L)

无水d-葡萄糖

5.5 × 10-3 M (0.1%)

1.0

CaCl2.2H2O

5.0 × 10-5 M

0.0074

MgCl2.6H20

9.8 × 10-4 M

0.1992

KCl

5.4 × 10-3 M

0.4026

TRIS

0.145 M

17.565

溶于约950 ml的蒸馏水中并加入浓盐酸至pH为7.6，然后将体积调整为1L。

溶液B

浓度(g/L)

NaCl

0.14 M

8.19

在进行平衡盐溶液制备是，将一份体积的溶液A与九份体积的溶液B进行混合。溶液应每周新鲜制备。其他标准盐溶液可能也会被用到。

Ficoll-Paque产品

在使用前将Ficoll-Paque密度梯度培养基预热至18°C到20°C。对于大于3 ml的样品，请参照备注。

样品制备

应当使用新鲜的血液以确保分离的单核细胞的高活性。样品应在18°C到20°C间进行制备。

或抗凝处理的血液以及等体积的平衡盐溶液（终体积为4ml）。

倒置管数次将血液和缓冲液混匀，或通过上下吹打将混合液混匀。

单核细胞分离过程

将Ficoll-Paque培养基瓶倒置数次充分混匀。
如果通过注射器吸取Ficoll-Paque培养基：将聚丙烯盖子拉开并将注射器针头穿过隔垫（图1）。
Ficoll-Paque培养基：取下折断式聚丙烯盖。抬起铝圈。拔下金属密封圈。取下银环。
移去橡胶封口。在无菌条件下，吸取所需体积的Ficoll-Paque培养基（图2）。

加入Ficoll-Paque培养基（3 mL）至离心管中。

小心将稀释的血液样品（4 mL）铺在Ficoll-Paque培养基溶液上（图3）。
重要：在铺垫样品时不要将Ficoll-Paque培养基和稀释的血液样品进行混合。

18ºC至20°C条件下400 g离心30至40分钟（应当关闭制动）。