cell RNA在非肿瘤生信中相遇？

作者：杨超月

腰痛是一种广泛而复杂的临床病症，在超过 40%的慢性腰痛病例中，没有神经受压的证据。椎间盘（IVD）变性被认为是疼痛的主要原因。IVD已被确定为免疫豁免器官，因为其独特的结构将髓核(NP)与宿主的免疫系统隔离开来，其中纤维环(AF)、软骨终板和免疫抑制分子因子组成血液-NP屏障。当血-NP屏障受损时，NP会触发免疫反应。这一过程在 IVD变性中起着至关重要的作用。然而，免疫景观和表观遗传调控在 IVD变性病理过程中的作用仍不清楚。

在这项研究中，研究者们先基于传统的组织总RNA（bulk RNA）测序数据确定了参与 IVD变性的特定类型的免疫细胞并筛选了相关的Hub基因；而后通过公共单细胞测序数据（scRNA-seq）分析揭示了 NP细胞簇中Hub基因的表达模式；此外，还收集了一些临床样本探索了Hub基因的预后价值。

揭示免疫浸润景观并识别腰椎间盘突出症的诊断生物标志物

cell RNA在非肿瘤生信中相遇？

01

摘要

椎间盘(IVD)退变及其炎症微环境最终导致椎间盘源性疼痛，被认为起源于髓核(NP)。本研究通过生物信息学分析鉴定了腰椎间盘突出症(LDH)NP组织免疫浸润相关的关键基因。从GEO数据库下载基因表达谱。采用CIBERSORT算法分析LDH组和对照组间NP组织的免疫浸润情况。通过Bioconductor中的WGCNA R包鉴定Hub基因，并使用R包分析单细胞测序数据。通过qRT-PCR评价基因表达水平。LDH组和对照组之间的免疫浸润特征存在显著差异。与对照组织相比，LDH组织含有更高比例的调节T细胞和巨噬细胞，其与巨噬细胞极化过程相关。最显著的模块包含3个hub基因和4个NP细胞亚簇。对这些基因进行功能分析，通过PCR证实hub基因表达模式，并调查患者的临床特征。最后，我们确定TGF-b和MAPK信号通路在这一过程中是至关重要的，这些通路可能为LDH提供诊断标志物。我们推测，在特定的NP亚簇中表达的hub基因，以及浸润的巨噬细胞在IVD退变和最终椎间盘突出的发病机制中起重要作用。

02

研究流程

cell RNA在非肿瘤生信中相遇？

差异表达基因鉴定

CIBERSORT免疫细胞估算

WGCNA识别与重要免疫细胞相关的Hub基因

单细胞水平检测Hub基因的表达模式并识别与LDH相关的NP细胞

qRT-PCR和ELISA验证Hub基因表达与临床特征之间的关系

03

结果简述

3.1

数据收集和临床样本信息

1. 组织总RNA转录组数据（人体椎间盘）：

GEO数据库 (GSE124272、GSE147383和GSE153761)

2. 单细胞转录组数据（褐家鼠椎间盘）：

GEO 数据库(GSE154884)

3. 临床样本：

9名因单节段腰椎间盘突出症（MRI分类为 Pfirrmann IV级）引起放射痛而接受后路开放式椎间盘切除术的患者。

（对照组）14名因单节段腰椎间盘突出症（MRI分类为 Pfirrmann I至 III级）导致神经系统症状而接受了后路开放式椎间盘切除术的患者。

每个患者的免疫反应被评估为“高（H）”或“低（L）”：通过总淋巴细胞百分比是否高于中位水平32或CD4-CD8-淋巴细胞百分比低于中位水平6来评估每个个体的免疫状态，详见 Table 1。

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3.2

高低级别LDH差异表达基因和免疫浸润景观

基因差异表达分析：edgeR包，LDH ( IV级) vs. LDH (I至 III级)

结果：共识别410个DEGs【图2A】

免疫细胞浸润比例评估：CIBERSORT

结果：Tregs和巨噬细胞水平显着升高（p<0.05）【图2B】。肥大细胞、中性粒细胞与M1巨噬细胞呈强正相关，而浆细胞、调节性T细胞与M1巨噬细胞浸润呈负相关【图2C】。

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3.3

WGCNA识别与重要免疫细胞相关的模块Hub基因

WGCNA：纳入基因为410个DEGs；模块聚类后与调节性T细胞、巨噬细胞构建相关关系【图3A-C】。