酵母杂交那些事儿（一）

作者：张馨予

酵母单杂、酵母双杂、酵母三杂，仅仅一个字的区别，你对它们了解吗？这些经常用到的实验，它们的原理你确定都搞清楚了吗？如果没有，那么今天你就来对地方了，因为伯小远下面打算非常详细的给你讲一遍它们的原理，让你以后不再为不懂原理而烦恼！

在了解酵母杂交实验之前我们先来了解一个转录因子——Gal4，了解它可以帮助大家更好的理解酵母杂交实验的原理！

Gal4转录因子

真核基因转录受大量调控因子调节。进化保守的Gal4是真核细胞普遍存在的转录激活因子。在半乳糖的诱导下，酵母Gal4结合在半乳糖代谢酶系GAL基因启动子的上游激活序列（Upstream activating sequence，UAS）上，调控Galactokinase（Gal 1），Galactose permease（Gal2），Galactose 1-phosphate uridyltransferase（Gal7），Galactose mutarotase and UDP-galactose 4-epimerase（Gal10）等基因的转录。

酵母单杂交与酵母双杂交

酵母单双杂实验的意义

生物体内各种生物分子之间的复杂调控网络构成了生命过程的基础。这些网络控制着胚胎如何发育成多细胞生物、该生物如何维持稳态以及如何对病原体或疾病作出反应等。参与这些网络的生物分子包括DNA、RNA、蛋白质和代谢产物等小分子。这些生物分子之间一般会存在相互作用共同调控复杂的生命过程，为了解析这些相互作用，酵母单杂、酵母双杂就成为了必不可少的研究手段！

酵母单杂原理

酵母单杂（Y1H）是在酵母双杂的基础上发展而来的，按理说应该先介绍酵母双杂的原理，但是考虑到酵母双杂还存在核体系与膜体系的区别，这里就先介绍酵母单杂吧！

基本的Y1H分析包括两个载体（图1）：（1）包含感兴趣的DNA（通常被称为诱饵（Bait））和报告基因融合的载体，该报告基因编码的蛋白易于检测；（2）包含感兴趣的转录因子（TF，通常被称为猎物（Prey））和酵母转录激活域（AD）融合的载体。这两种载体都被转入到合适的酵母菌株中，如果TF在酵母核的环境中与DNA结合，那么AD就会诱导报告蛋白的表达。重要的是，无论TF是激活因子还是抑制因子，酵母AD都会激活报告因子，因此，Y1H分析的是蛋白质和DNA之间的相互作用。

酵母杂交那些事儿（一）

图1 酵母单杂实验原理(Ouwerkerk, Pieter BF.and Annemarie H., 2001)（不同的实验体系可能会存在一些差异，但原理基本都差不多，这里主要帮助大家理解原理）。

酵母杂交那些事儿（一）

图2 Y1H分析的变化和注意事项概述(Sewell Jared A.and Juan I. Fuxman Bass, 2018)。利用限制性内切酶（RE）或Gateway技术将复杂调控区、转录因子结合基序或非编码变异的DNA序列克隆至报告基因上游。这些结构最常被整合至酵母基因组中以产生DNA诱饵菌株。然后将DNA诱饵菌株转化或与一组猎物克隆（ORF融合到Gal4的激活结构域AD上）交配。编码猎物的载体可以是低拷贝（ARS/CEN）或高拷贝（2μ）的。筛选可以以文库进行筛选，其中阳性菌落必须进行测序和重新测试，同时，也可以以阵列的形式进行筛选，阳性菌落的位置表明相互作用的转录因子（TF）的身份。

说明：酵母单杂筛库是以DNA为诱饵筛选与其互作的转录因子，如果你想要通过转录因子筛选与其互作的DNA，用到的方法应该是ChIP-seq。这个大家一定要区分清楚哦！

酵母双杂原理

（1）核体系酵母双杂

1989年，Fields和Song通过描述一个遗传系统来检测酵母细胞(Fields Stanley and Ok-kyu Song,1989)中蛋白质-蛋白质的直接相互作用，从而彻底改变了蛋白质相互作用分析的研究方法。在此之前，两种蛋白质之间的相互作用主要是利用生化技术来进行研究的。这一全新的分析工具的发现是由真核转录因子的分子分析引发的。在该项发现被公布的前几年，Ptashne实验室发现了酵母中转录激活因子Gal4的模块化结构。他们表明，Gal4结合一个特定的DNA序列（上游激活序列，UAS），从而在半乳糖存在的情况下激活转录。如果分离成两个片段，N端片段仍然可以与DNA结合，但在半乳糖存在时不激活转录，而激活的功能是由C端片段(Keegan et al., 1986)介导的。然而，这两个片段可以相互作用和非共价重建成一个有功能的Gal4。因此，研究者确定了Gal4的两个不同功能域：N端DNA结合域（DBD）和C端DNA激活域（AD），这两个独立的功能域独立于另一个的存在而保持各自的功能。