NRR国际润色专家意见：如何完善qPCR和免疫荧光组

作者：张馨予

原创 NRR国际润色专家意见：如何完善qPCR和免疫荧光组织(细胞)化学染色方法描述

2022-04-29 17:11 来源: 中国神经再生研究杂志

原标题：NRR国际润色专家意见：如何完善qPCR和免疫荧光组织(细胞)化学染色方法描述

润色专家的意见：Was this performed using a kit? Please describe how the quantification was performed and whether any controls were used. Was normalization performed?

译文：针对“Reverse transcription was performed on the extracted RNA”部分，用到了什么试剂盒？请描述如何进行量化，是否使用了任何对照。是否进行了归一化处理？

编辑解读：qPCR实验方法应当按照“qPCR实验操作和文章发表指南：MIQE清单”中的要求进行，其必备的描述包括：

-样本采集、处理和制备：样本来源于哪个物种、器官、组织。并简要描述样本，例如：肿瘤样本描述肿瘤细胞组织比例。RNA提取于新鲜组织还是冰冻组织（如果是冰冻，如何冰冻，冻了多长时间）。

- 核酸的质量控制：RNA的提取（操作环境、试剂、耗材中有无RNAase）、RNA的定量（用何种方法定量，量是多少），去除基因组DNA（gDNA）[描述gDNA污染程度，说明RNA样本是否经过DNase处理（包括DNase类型和反应条件）]，质量评估[质量评估方法和结果（推荐使用凝胶电泳或微流控芯片rRNA分析）]，杂质残留（通过稀释样本做反转录来检测PCR抑制剂的存在，或者用SPUD等抑制试验）。

-反转录：描述反转录的方法和试剂，包括：RNA模板量、引物种类、酶的类型与数量，反应体系及反应的时间和温度。

-qPCR：基因信息（靶基因和参考基因的数据库登陆号（如：NCBI Gene数据库：基因id和序列的Accession Number），目标核酸的结构，目的基因长度）。引物信息（序列和浓度，结合位点。染料或探针：染料种类、探针序列）。实验设计（内参基因的选择、复孔、阴性阳性对照）。反应体系及反应条件（聚合酶的名称和浓度、模板量、缓冲液化学组成，反应体系总量，反应温度及循环数(initial denaturation预变性-denaturation变性- annealing退火- extension/ elongation延伸）。仪器耗材（塑料耗材的透明度如货品，反应容器为单一管，排管还是板，制造商；当使用板时，还要提供板的密封方法）。

-数据分析：标准曲线（对第一对引物制作标准曲线来分析扩增效率）。实验组和对照组的Ct（Cq）值。数据计算方法和归一化方法。数据重复性如何。统计方法和计算软件。

润色专家的意见：The staining protocol describes the freezing of brain tissue, the use of fresh tissue, and the use of paraffin-embedded tissue without establishing whether these are all the same samples or whether some samples were reserved for each treatment process or whether the brains were divided to accommodate all of these needs. It is not clear how the brain tissue was treated after removal to achieve all of the methods described here. Please clarify these issues.

译文：荧光免疫染色方法描述了脑组织的冷冻、新鲜组织的使用和石蜡包埋组织的使用，但没有确定这些是否都是相同的样本，或者是否为每个处理过程保留了一些样本，或者是否对大脑进行了分割以适应所有这些需求。目前还不清楚切除后的脑组织是如何处理以实现这里描述的所有方法的。

编辑解读：请记住，材料和方法部分应包括足够的细节，以便未来的研究人员在需要时复制你的实验。还要注意的是，在英语描述时，要注意冰冻切片和石蜡切片所用切片机的不同，也就是“A cryostat is not used for paraffin-embedded sections. Only frozen sections are sectioned with a cryostat. A microtome is used for paraffin.”

润色专家的意见：Was there any reason why only male mice were used in this study? Please specify if so.

译文：本研究中只使用雄性小鼠是否有什么原因？如果是，请具体说明。

编辑解读：因为动物的性别可能是实验结果的影响因素，因而如果实验中明确使用单一性别的动物，需要说明使用该性别动物原因，并提供文献支持。

润色专家的意见：Please clarify what you mean here by fresh tissue sections if the brain tissue was immediately frozen. Are you referring to non-brain tissue or was only some of the brain tissue frozen? Please clarify. Please also clarify how sections were obtained and what thickness was used, and whether the sections represent coronal or sagittal sections.