作科所联合多家单位构建大麦突变体库和TILLING技
作科所联合多家单位构建大麦突变体库和TILLING技术平台助力大麦种质创新和功能基因研究
2022-03-16 11:45 来源: 教育的灵魂
原标题：作科所联合多家单位构建大麦突变体库和TILLING技术平台助力大麦种质创新和功能基因研究
2022年3月12日， Plant Communications在线发表了中国农业科学院作物科学研究所 杨平课题组与合作者题为 A reference-guided TILLING by amplicon-seq platform supports forward and reverse genetics in barley 的研究论文， 构建了一个大麦突变体库和基于扩增子测序技术的TILLING筛选技术平台。
理化诱变是创制遗传变异的经典方法，与基因编辑技术可以优势互补，在种质创新、遗传育种和新基因发掘等方面发挥了重要作用。甲基磺酸乙酯（EMS）化学诱变可产生G-A和C-T的碱基转换，多数引起编码蛋白质的氨基酸替换，少数可造成蛋白翻译提前终止或编码框位移。据国际原子能机构统计数据显示，理化诱变选育的植物新品种>3300个，涉及214个物种。
大麦是世界第四大禾本科粮食作物，是重要的动物饲料和啤酒酿造原料，在我国青藏高原地区是藏族同胞的主要口粮（裸大麦，又被称为青稞）。大麦是二倍体自花授粉作物、基因组小、全球种质资源丰富且遗传转化体系完善，加之麦类作物中基因功能高度保守，大麦研究可以为其它麦类作物研究提供参考。在啤酒大麦中，国外团队通过理化诱变构建了多个突变体库，支撑了穗棱型（ Vrs1 - Vrs5 ）、籽粒皮裸性（ Nud ）、抽穗期（ MAT-a 和 MAT-c ）、白粉病和黄花叶病抗性（ mlo 、 Mla 和 rym1/11 ）等多个性状重要基因的发掘和功能研究。
图1 大麦地方品种“哈铁系”的形态（A），品质特征（B），遗传来源（C）和诱变群体的构建示意图（D）。
“哈铁系”（HTX）是具有欧亚混合血缘的我国东北地区大麦地方品种，其成熟后期全株变黑。与主栽大麦品种相比，其籽粒具有高蛋白、高纤维、低脂、低淀粉等特点，是食用或饲用大麦种质资源创新和新基因发掘的理想材料。中国农业科学院作物科学研究所大麦基因资源课题组以“HTX”为材料创制了一个EMS化学诱变群体，获得了包括8,525份M2家系单株DNA样品及其对应的M3种子，其中约15%的M2家系存在形态或发育表型变异，暗示该群体具有丰富的遗传变异。为了更好地辅助该群体的应用，研究者结合Illumina、PacBio和Hi-C测序技术，构建了“HTX”染色体水平的高质量参考基因组。
图2 EMS诱变群体部分M2单株的表型变异示例。 A，植株卷曲；B，脆茎；C，多节并矮化；D，叶色变浅；E，条纹叶；F，整株黄化；G，类病斑；H，整株无蜡质；I，穗六棱；J，密穗；K，穗包裹；L，多芒。
随后，研究者利用三维混池技术和扩增子测序技术，建立了一套经济高效的TILLING突变体筛选系统，可从64倍或144倍DNA样品混池中鉴定出目标基因的突变位点，准确率高达90.48%。研究者采用传统的 Cel I酶切毛细管电泳、全基因组重测序和扩增子测序等三种策略，发现该群体的突变频率为1.5-4.1个突变位点/Mb。对510个突变位点进行蛋白编码水平的效应预测，其中40.6%的突变位点导致氨基酸非同义突变、2.7%的突变位点导致蛋白翻译提前终止或编码框位移。
图3 基于突变体DNA三维混池和多扩增子混合测序的TILLING筛选技术。 A，以512份DNA为例进行三维混池示意图；B，多基因扩增子产物混合与回收纯化；C，24个混池中鉴定到3个突变位点；D，追踪携带突变位点的M2突变单株。
为了证实该群体在遗传学研究中的利用价值，研究者一方面通过反向遗传学策略，利用基于扩增子测序的TILLING筛选技术，从2,240份M2个体中鉴定到大麦半矮秆基因 HvBRI1 的12个突变体，M4代纯合植株的株高显著降低；另一方面，研究者针对一个全株黄化突变体，利用MutMap策略快速克隆了导致该表型变异的目标基因，证实了这套资源在正向遗传学研究中的利用价值。值得一提的是， 利用此TILLING技术和突变群体中5184个M2样本，已对来自十余家科研院所的数十个目标基因开展了突变体筛选服务，平均获得21个突变体/1.5kb目标片段。该研究平台的建立将为我国大麦种质创新、新基因发掘和功能研究提供有力支撑。
图4 全株黄化突变体M4009的鉴定和突变基因快速克隆
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