一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

1.本发明属于病原微生物检测及分子诊断的技术领域，具体涉及一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用。

背景技术：

2.v.vulnificus是海洋中最常见的弧菌科细菌之一，广泛分布在近岸海域的海水、海洋生物的体表和肠道中，人类感染这种细菌一般有两种途径：使用海鲜与接触海水或海产品。v.vulnificus是一种危险的人类病原体，是所有食源性病原体中病死率最高的。v.vulnificus感染的特点是潜伏期短，通常在感染的24h内就会出现症状，在48h内出现感染性休克、皮肤肌肉坏死、脓毒血症，进而引起多脏器功能衰竭，伤口感染的总死亡率约为25％，但在患有潜在肝病的患者中上升至54％。由于这种细菌可引起严重感染，及时进行抗菌治疗是必不可少的。因此，在临床环境中准确快速地识别这种细菌是至关重要的。
3.大多数临床微生物学实验室仍然依靠培养来检测临床样本中的v.vulnificus。例如，使用选择培养基分离特定目标病原体，分离出细菌后，利用maldi-tof ms鉴定v.vulnificus，其检测具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。但是依靠培养来检测临床样本中的v.vulnificus的方法仍存在一些局限性，检测时间通常需要16～48h，且无法检测一些难以进行分离培养的病原微生物，因此，目前主要用于培养基础上的鉴定。近年来，使用pcr检测手段得到快速发展，可进行种属水平的鉴定，各种以pcr为基础的dna扩增技术如荧光定量rcr、逆转录pcr、数字pcr等技术，已成为医学临床和检验部门强有力的分析工具，
4.在实际应用场景下，待检测样本中病原微生物含量低，需经过核酸扩增获取大量目标基因片段，因此，pcr检测手段进行v.vulnificus的快速识别成为一种具有较大发展潜力的方法。但是，现有的各种pcr技术需要热循环过程，无法摆脱对仪器设备的依赖，从而限制了其在临床现场检测v.vulnificus中的应用。

技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关及其制备方法，并将制得的基于无细胞转录翻译系统的核糖开关用于现场即时检测v.vulnificus。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明目的之一在于提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，所述核糖开关是根据细菌保守序列rna设计的具有立足结构的rna序列，可与v.vulnificus保守序列rna发生碱基互补配对，激活报告蛋白的表达；所述核糖开关是由两条rna链组成，分别为sensor rna和trigger rna，sensor rna为核糖开关，trigger rna用于激活核糖开关；sensor rna序列由sensor dna序列体外转录而来，trigger rna序列由trigger dna序列体外转录而来。
8.进一步的，所述trigger dna序列是由带有pt7启动子的上游引物和下游引物从v.vulnificus中等温扩增而来，上游引物的序列如seq id no:1所示，上游引物的序列如seq id no:2所示，trigger dna序列如seq id no:3所示。
9.进一步的，所述sensor dna序列是可编程的，根据所选择的v.vulnificus保守序列trigger dna设计而来，sensor dna序列如seq id no:4所示。
10.本发明的目的之二在于提供如上所述的基于无细胞转录翻译系统的核糖开关在临床检测v.vulnificus中的应用。
11.进一步的，将基于无细胞转录翻译系统的核糖开关在临床检测v.vulnificus中的应用，包括以下步骤：
12.利用rpa等温扩增方法对v.vulnificus保守序列进行扩增，在无细胞转录翻译系统中，扩增产物在t7 rna聚合酶的作用下，t7启动子启动转录过程，以得到大量trigger rna；
13.无细胞转录翻译系统中，sensor dna转录出核糖开关sensorrna，以识别trigger rna，激活报告蛋白的表达；
14.根据表达的报告蛋白与底物的显色反应，从而确定目标菌为所检测v.vulnificus。
15.相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
16.1、本发明提供的核糖开关中sensor rna与v.vulnificus保守序列rna的识别是依赖于rna-rna的链置换相互作用，通过碱基互补配对的原则，解除rna适体立足结构对翻译过程的阻遏作用，从而促进报告蛋白的表达；根据实验数据表明，本发明所设计的核糖开关具有高动态范围、高特异性等特点，同时核糖开关通过可编程的设计，具有高通用性以响应任意rna序列。
17.2、本发明中无细胞转录翻译系统(tx-tl)是v.vulnificus利用细胞粗提物以代替完整细胞来启动转录翻译过程，它可以绕过分子跨细胞壁运输的限制，通过向提取液中加入遗传物质和外源能量，在短时间内体外启动mrna和蛋白质的合成，将tx-tl系统与本发明设计的核糖开关相结合，应用于病原微生物的检测，可提高检测的便捷性和及时性。实验数据表明，在不依赖于设备仪器的情况下，可在3h内实现v.vulnificus保守序列的检测。
18.3、在实际应用场景下，待检测样本中病原微生物含量低，需经过核酸扩增获取大量目标基因片段，本发明在实际应用中利用rpa等温扩增技术进行扩增，缩短扩增时间、且稳定性强，可实现在常温下目标基因片段的指数级扩增；本发明将rpa等温扩增技术与核糖开关相耦合，结合tx-tl系统，检测v.vulnificus的保守序列，实现检测的灵敏度为4.30
×
103copies/μl。
附图说明
19.图1为本发明核糖开关报告子为degfp基因时，v.vulnificus的sensor质粒与trigger质粒在tx-tl体系中不同浓度下的反应结果示意图；
20.其中，图(a)、(b)为sensor-v1质粒；图(c)、(d)为sensor-v2质粒；图(e)、(f)为sensor-v3质粒；
21.图2为本发明核糖开关报告子为lacz基因时，sensor-v2质粒在不同浓度下的反应
结果示意图；
22.其中，图(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分别为sensor-v2质粒浓度为0、5、10、20、30nm时的实时反应结果图；图(f)为反应时间为3h时，sensor-v2质粒各浓度下的反应终点值；
23.图3为本发明中不同体积rpa等温扩增产物与适宜浓度下的核糖开关的反应示意图；
24.图4为本发明中rpa-核糖开关的检测trigger-v2质粒dna灵敏度的实时结果图；
25.其中，图(a)为在不同dna浓度模板下，rpa-核糖开关的检测trigger-v2质粒dna灵敏度的实时结果图；图(b)为反应时间为3h时的终点图。
26.图5为本发明中核糖开关sensor-v2质粒冻干前与冻干后检测trigger-v2的反应结果示意图；
27.图6为本发明中tx-tl核糖开关sensor-v2质粒的特异性检测结果示意图。
具体实施方式
28.下面结合较佳实施例对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
29.实施例1
30.一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，所述核糖开关是根据细菌保守序列rna设计的具有立足结构的rna序列，可与v.vulnificus保守序列rna发生碱基互补配对，激活报告蛋白的表达；所述核糖开关是由两条rna链组成，分别为sensor rna和trigger rna，sensor rna为核糖开关，trigger rna用于激活核糖开关；sensor rna由sensor dna序列转录而来，转录出的sensor rna序列能使核糖体结合位点(rbs)处的序列形成一种特殊的二级结构——发夹结构，这种发夹结构会使得核糖体不能与核糖体结合位点(rbs)结合，从而翻译过程不能启动；trigger dna在体外表达系统中能够转录出60bp长度的trigger rna；
31.其中，所述trigger dna序列是由带有pt7启动子的上游引物(seq id no:1)和下游引物(seq id no:2)从v.vulnificus利用等温扩增技术在37℃下扩增而来，得到带有pt7启动子的trigger dna序列(seq id no:3)，
32.上游引物：5
’‑
aagtaatacgactcactataggcaccagggataactccccg；下游引物：5
’‑
agttcacttcaagacgcagaaaaattggtgtt；
33.trigger dna序列：
[0034]5’‑
aagtaatacgactcactataggcaccagggataactccccgagctt gctggccaacaccaatttttctgcgtcttgaagtgaact；
[0035]
其中，sensor dna序列是可编程的，根据所选择的v.vulnificus保守序列trigger dna设计而来；
[0036]
sensor序列(seq id no:4)为：
[0037]5’‑
acgcagaaaaattggtgttggccagcaagctcggggagttgttatgag acaagaacagaggagacataacatgtccccgagc。
[0038]
trigger rna同sensor rna的部分序列是互补配对的，当两者在体外表达系统中发生互补配对后，sensor rna发夹结构被打开，使得sensor rna能够正常翻译报告蛋白。
[0039]
实施例2
[0040]
以degfp基因作为核糖开关sensor报告子，在tx-tl系统中筛选性能良好的用于检测v.vulnificus的核糖开关；
[0041]
1、用于检测v.vulnificus的核糖开关的设计；从metaphlan的数据库中挑选v.vulnificus三条特异性基因序列，从每条特异性标记基因中随机选取一段60bp长度的dna序列作为v.vulnificus的trigger dna中的识别序列，trigger dna包括pt7启动子-特异性基因序列-终止子，其中上游引物含有pt7启动子，下游引物含有终止子，利用这两条引物扩增特异性基因序列即可得到完整的trigger dna，分别命名为trigger-v1、trigger-v2、trigger-v3；将所选择的trigger序列输入到ncbi-blast页面进行比对，以证明这些序列具有物种特异性；将质粒骨架、启动子pj23151、triggerdna序列、t500等基因元件，采用golden gate assembly方法依次连接起来构建成完整质粒，即trigger质粒；已确定v.vulnificus trigger dna的序列后，根据trigger dna序列设计核糖开关sensor dna序列，再将质粒骨架、启动子pj23151、sensor dna序列、degfp、t500等基因元件，采用golden gate assembly方法依次连接起来构建成完整质粒，即sensor质粒；
[0042]
2、以degfp基因为核糖开关报告子，将v.vulnificus核糖开关sensor质粒与trigger质粒加入到tx-tl反应体系，核糖开关sensor质粒的浓度分别为0、5、10、20nm，trigger质粒浓度分别为0、10、20、30nm，在29℃下反应8h，用酶标仪检测出gfp绿色荧光蛋白的荧光值；
[0043]
3、在tx-tl体系中筛选v.vulnificus核糖开关，其结果如图1示；从图中可以看出，随着trigger-v1浓度的增加，荧光值并没有显著增加，说明核糖开关并没有被激活；这可能是因为核糖开关sensor-v1 rna形成的立足结构太稳定，导致trigger-v1 rna与sensor-v1 rna的结合并不能破坏核糖开关立足结构，因此报告蛋白表达水平低，核糖开关sensor-v1需舍弃；核糖开关sensor-v2在不同浓度下泄漏表达低，同时随着trigger-v2浓度增加，荧光值逐渐升高，sensor-v2和trigger-v2浓度分别为20nm和30nm时有最高激活倍数为8.38(图1c)，说明此核糖开关性能良好；核糖开关sensor-v3浓度为20nm及以内时，核糖开关并没有被trigger-v3激活；sensor-v3浓度为30nm时，最大激活倍数仅2.86，这些结果说明核糖开关sensor-v3识别trigger-v3效果差，不能用于检测v.vulnificus。因此，本实施例中选择sensor-v2作为检测v.vulnificus的核糖开关。
[0044]
实施例3
[0045]
以lacz基因作为核糖开关sensor报告子，验证核糖开关性能，以cprg作为酶底物，实现v.vulnificus核糖开关检测结果的可视化；
[0046]
1、选用实施例1中sensor-v2作为检测v.vulnificus的核糖开关，将质粒骨架、启动子pj23151、sensor-v2序列、lacz、t500等基因元件，采用golden gate assembly方法依次连接起来构建成完整质粒；
[0047]
2、以lacz基因为核糖开关报告子，将v.vulnificus核糖开关sensor质粒与trigger质粒加入到tx-tl反应体系，核糖开关sensor质粒的浓度分别为0、5、10、20、30nm，trigger质粒浓度分别为0、5、10、20nm，在29℃下反应3h，用酶标仪检测出420nm和570nm波
长下的吸光值用相对吸光度(a
570
/a
420
)来表征反应物的颜色；
[0048]
3、sensor-v2是以degfp基因作为报告子筛选后得到的v.vulnificus的核糖开关，以lacz基因为报告子验证该核糖开关，其结果如图2所示；从图中可以看出，当sensor-v2浓度为5nm时，虽然泄露表达较低，但是trigger-v2质粒浓度在20nm时，才能激活核糖开关sensor-v2，说明核糖开关sensor-v2浓度在5nm时的表达量很少；当sensor-v2浓度为10nm时，泄露表达较低，同时随着trigger-v2浓度升高时，a
570
/a
420
值逐渐升高，明显区别于泄露表达，sensor-v2浓度为20nm，反应在150～180min阶段达到平台期，反应时间在120min时，20nm trigger-v2显著激活核糖开关sensor-v2(图2f)。
[0049]
实施例4
[0050]
将基于无细胞转录翻译系统的核糖开关在临床检测v.vulnificus中的应用，包括以下步骤：
[0051]
利用rpa等温扩增方法对v.vulnificus保守序列进行扩增，在无细胞转录翻译系统中，扩增产物在t7 rna聚合酶的作用下，t7启动子启动转录过程，以得到大量trigger rna；
[0052]
无细胞转录翻译系统中，sensor dna经过转录得到核糖开关sensor rna，以识别trigger rna，激活报告蛋白的表达；trigger rna同sensor rna的部分序列是互补配对的，当两者在体外表达系统中发生互补配对后，sensor rna发夹结构被打开，使得sensor rna能够正常翻译报告蛋白；
[0053]
根据表达的报告蛋白与底物的显色反应，从而确定目标菌为所检测v.vulnificus。
[0054]
实施例5
[0055]
利用rpa等温扩增技术与核糖开关相耦合，用于临床检测v.vulnificus，并提高检测灵敏度。
[0056]
1、以v.vulnificus trigger dna为模板，利用rpa等温扩增试剂盒对trigger dna序列进行扩增；将反应体系置于37℃金属浴中孵育30min，每隔4min取出样品涡旋混匀一次，随后，在80℃孵育10min，终止扩增反应；扩增产物在t7 rna聚合酶的作用下，t7启动子启动转录过程，以得到大量trigger rna；
[0057]
2、确定sensor-v2质粒浓度为20nm，在无细胞转录翻译系统中，sensor dna转录出核糖开关sensorrna，rpa扩增产物为trigger rna，体积分别为0、0.5、1、1.5μl，在反应体系中，核糖开关sensorrna识别trigger rna；将反应体系转移到384孔板中，置于酶标仪中实时检测样品吸光值，反应温度为29℃，反应时间为180min，以相对吸光值a570/a420作为纵坐标，其结果如图3所示，在加入1μl和1.5μl rpa扩增产物时，3小时内可明显看出与对照组(0μl rpa)的区别；
[0058]
为探究rpa-核糖开关检测的灵敏度，将trigger-e4、trigger-s3、trigger-v2质粒dna做10倍梯度稀释，用rpa扩增试剂盒分别进行等温扩增；dna浓度依次为1
×
10-1
、1
×
10-2
、1
×
10-3
、1
×
10-4
、1
×
10-5
、1
×
10-6
、1
×
10-7
、1
×
10-8
、0ng/μl。将不同浓度梯度的trigger dna作为模板，经rpa扩增后，将扩增产物与核糖开关sensor质粒在无细胞转录翻译体系中反应，结果如图4所示；从图4中可以看出，未加rpa扩增产物时核糖开关sensor-s3、sensor-v2泄露较低，rpa扩增产物加入量为1.5μl时，核糖开关的激活效果最好，rpa等温扩增与核
糖开关相耦合用于检测v.vulnificus的灵敏度分别为1
×
10-7
ng/μl。
[0059]
实施例6
[0060]
为了便于试剂的储存和运输，应用于多样化场景，本实施例中将反应体系冷冻干燥，制成颗粒状固体物质；
[0061]
加入适量无菌水，使终体积与冻干前一致，比较冻干前与冻干后的反应结果；将样品震荡混合均匀，放入液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱冷冻40min，放进冻干机中冷冻干燥5h，冷冻干燥温度为-55℃，真空度为5.4pa，在冷冻干燥后的反应体系中加入适量无菌水，使终体积与冻干前一致，分别比较冻干前与冻干后的反应结果，如图5所示；从图5可以看出，sensor在激活状态下，冻干后的相对吸光值要低于冻干前。然而，tx-tl体系无论在冻干前还是冻干后，rpa扩增的trigger-v2对tx-tl中核糖开关sensor-v2有明显的激活作用。这些结果说明，经冻干后反应体系整体活性有所下降，但仍然可实现核糖开关检测靶dna。
[0062]
实施例7
[0063]
为探究基于核糖开关和tx-tl系统检测的特异性，本实施例中选取14种菌株，进行特异性检测试验；
[0064]
挑取各细菌单菌落混匀在无菌去离子水中，于沸水中煮沸20min，制备成待测样品，使用trigger-v2的引物对处理后的样品进行rpa等温扩增，扩增后的产物使用基于tx-tl的核糖开关sensor-v2反应体系进行检测，在29℃下孵育3h，检测反应液的相对吸光值a570/a420，结果如图6所示；
[0065]
从图6中可以看出，在十四种细菌中，唯有v.vulnificus atcc29307的扩增产物能被基于核糖开关sensor-v2的反应体系检测出阳性结果，其他细菌扩增产物未被检出，说明基于核糖开关和tx-tl系统检测v.vulnificus具有良好的特异性。
[0066]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。