Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测

作者：张馨予

C-Src蛋白酪氨酸激酶（C-Src tyrosine kinase，Csk）是Src激酶家族（SFKs）的成员，为SFKs的负调节蛋白[]。Csk分子量为51 kD，属于非受体酪氨酸激酶，其N末端有SH3和SH2结构域，C末端含有激酶结构域[]。目前对于Csk的研究，多集中于Csk对SFKs的作用机制及其在免疫系统中的作用。研究发现，SFKs参与多种重要的生理过程，如细胞生长分化及黏附、蛋白的转录等[]，同时在多种肿瘤如胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等的发生发展中起到重要作用。据文献[, ]报道，通过抑制SFKs可以抑制肺癌的迁移。已有实验表明，作为SFKs的负调节蛋白，Csk可以通过抑制SFKs激酶的磷酸化发挥抑制肿瘤的作用[, ]。但Csk如何调控SFKs的具体机制尚不确定。Csk是非受体酪氨酸激酶，需跨膜受体如IGF1受体、EGF受体、T细胞受体[, ]或跨膜衔接蛋白如CBP[]等的帮助完成信号传递。推测Csk发挥功能与其同这些蛋白的相互作用有关。

为获得有生物活性的Csk蛋白，进而研究Csk调控SFKs的分子机制，本研究从HeLa细胞中通过RT-PCR方法获得目的基因，连接到高效真核表达载体pENTER上，构建重组真核表达质粒。将重组质粒转染到293T细胞中进行蛋白表达，并用SDS-PAGE、Western blot、his-pulldown及CO-IP等方法观察和鉴定重组Csk蛋白表达情况和生物活性，旨在为进一步研究Csk蛋白通路及其对SFKs的调控作用奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、细胞与载体

HeLa、293T细胞由南方医科大学抗体工程研究所保存；TOP10感受态细胞购自TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；pENTER载体购自ViGene Biosciences。

1.1.2 主要试剂

胎牛血清（FBS），DMEM培养基购自Gibco公司；RNA提取试剂盒，逆转录酶Reverse Transcriptase M-MLV购自Invitrogen公司；Prime STAR Max酶，限制性内切酶Mlu I，限制性内切酶AsiSⅠ，T4连接酶，DNA Marker DL5000购自TaKaRa公司；割胶回收试剂盒购自TIANGEN天根生化科技（北京）有限公司；质粒小提取试剂盒购自美国OMEGA公司；PolyJet DNA In Vitro Tranfection Reagent 购自Polyplus。兔源Csk、IGF1R抗体，鼠源抗His抗体，兔源GAPDH抗体，羊抗兔IgG-HRP，羊抗鼠IgG-HRP购自Bioworld公司。螯合镍的磁珠购自海狸巴西vs瑞士让球有限公司。

1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成

从GenBank中获取Csk基因序列（NM_004383），根据cDNA中的序列，利用Primer 5.0软件进行引物设计，并在引物上游加入限制性内切酶位点以及保护碱基，上游引物：5'-CGCGATCGCATGTCAGCAATACAGGCCG-3'（下划线部分为AsiSⅠ酶切位点），下游引物：5'-TACGCGTTCAGGTGCAGCTCGTGGGTTT-3'（下划线部分为MluⅠ酶切位点），扩增片段大小为1 367 bp。所有引物由艾基生物公司合成。

1.2.2 获取目的基因Csk

用10% FBS的DMEM培养液常规培养HeLa细胞，利用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，按照MLV逆转录试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，PCR体系为：cDNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL，总体积50 μL。PCR反应条件：98℃ 5 min；98℃ 10 s，65℃ 5 s，72℃ 20 s，34个循环；72℃ 10 min，4℃保存。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定并使用割胶回收试剂盒回收。

1.2.3 构建重组真核表达载体pENTER-Csk-his

将获得的Csk基因片段与pENTER质粒进行Mlu Ⅰ和 AsiSⅠ双酶切12 h，产物分别经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离并使用割胶回收试剂盒回收。用T4连接酶在16℃条件下连接Csk基因片段回收产物与pENTER回收产物6 h。连接产物转化TOP10感受态细胞，转化液涂板培养37℃ 16 h，挑取菌落摇菌培养，利用质粒提取试剂盒提取质粒。经Mlu Ⅰ和 AsiSⅠ双酶切鉴定为阳性克隆后，送到艾基生物测序鉴定。

1.2.4 细胞培养与重组质粒转染

将293T细胞用含10% FBS的DMEM培养液在37℃，5% CO2条件下培养。当293T细胞生长状态良好后，消化分板，细胞接种到6孔板中，每孔4×105细胞，培养24 h后细胞达到生长期，按照PolyJet DNA In Vitro Tranfection Reagent转染试剂说明书，严格操作进行真核表达质粒转染，每孔转染操作如下，200 μL JetBuffer中加入1 μg pENTER-Csk-his重组质粒，轻柔混合后，按照比例1∶1、1∶2和1∶3分别加入1 μL、2 μL和3 μL PolyJet转染试剂，轻柔混合，静置15 min后，逐滴缓慢加入细胞中，轻轻摇匀，进行转染。转染后4 h更换新的含10%FBS的DMEM培养液，37℃，5% CO2条件下培养48 h。

1.2.5 Western

blot鉴定Csk蛋白在细胞中的表达分别收集加入1∶1、1∶2和1∶3不同比例的PolyJet转染试剂转染的293T细胞，弃去上清培养基后，每孔使用100 μL SDS-loading buffer直接加入细胞中，收集蛋白样品，沸水中煮15 min，取出14 000 r/min室温离心15 min。经12% SDS-PAGE进行蛋白电泳。用全湿法电转移到0.22 μm的PVDF膜上，配置5%脱脂奶粉室温封闭2 h，去除封闭液后，加入1∶10 000的抗His抗体、1∶1 000的Csk抗体和1∶10 000的内参GAPDH抗体，4℃过夜；次日，去掉一抗后，用TBST工作液洗涤3次，每次10 min，加入1∶10 000的羊抗鼠二抗与1∶10 000的羊抗兔二抗，室温孵育1 h；TBST工作液洗涤4次，每次10 min。使用GENE GNOME SYNGENE BIO IMAGING 仪器进行ECL显影。

1.2.6 间接免疫荧光检测Csk蛋白定位