CAS系统的噬菌体组合物及其使用方法与流程

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包含crispr-cas系统的噬菌体组合物及其使用方法
交叉引用
1.本技术要求于2019年11月6日提交的美国专利申请号62/931,795和于2020年10月6日提交的美国专利申请号63/088,394的权益，所述美国专利申请通过引用以其全部并入本文中。


技术实现要素：

2.在某些实施方案中，本文公开了包含crispr-cas系统的噬菌体组合物及其使用方法。
3.在某些实施方案中，本文公开了包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。在一些实施方案中，crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。在一些实施方案中，cascade多肽形成i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的cascade复合物。在一些实施方案中，cascade复合物包括：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，cas复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，仅通过噬菌体的裂解活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，仅通过crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性相组合杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过独立于噬菌体的裂解活性的crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，crispr-cas系统的活性补充或增强噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性和crispr-cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性、crispr-cas系统的活性或噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性两者均受噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，噬菌体感染多种细菌菌株。在一些实施方案中，靶细菌是不动杆菌
属(acinetobacter)物种、放线菌属(actinomyces)物种、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderia cepacia)复合种、弯曲杆菌属(campylobacter)物种、假丝酵母属(candida)物种、艰难梭菌(clostridium difficile)、微细棒状杆菌(corynebacterium minutissium)、假白喉棒状杆菌(corynebacterium pseudodiphtheriae)、纹带棒状杆菌(corynebacterium stratium)、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、肠球菌属(enterococcus)物种、大肠杆菌(escherichia coli)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、莫拉菌属(moraxella)物种、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)复合种、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseria meningitidis)、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属(porphyromonas)物种、产黑色素普雷沃氏菌(prevotella melaninogenicus)、假单胞菌属(pseudomonas)物种、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、唾液葡萄球菌(staphylococcus salivarius)、缓症链球菌(streptococcus mitis)、血链球菌(streptococcus sanguis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、球孢子菌属(coccidioides)物种、隐球酵母属(cryptococcus)物种、猫螺杆菌(helicobacter felis)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、鲍氏梭菌(clostridium bolteae)及其任何组合。在一些实施方案中，所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。在一些实施方案中，通过溶原性基因的去除、替换或失活而使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p004k或pb1。在一些实施方案中，核酸序列插入非必需噬菌体基因中。在一些实施方案中，本文描述了一种药物组合物，其包含：(a)本文所述的噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物呈片剂、液体剂、糖浆剂、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼用制剂、耳用制剂、皮下制剂、可吸入性呼吸制剂、栓剂和其任何组合的形式。
4.在一些实施方案中，本文公开了一种杀伤靶细菌的方法，所述方法包括将包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体引入靶细菌中，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。在一些实施方案中，crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。在一些实施方案中，cascade多肽形成i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的
cascade复合物。在一些实施方案中，cascade复合物包括：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，cascade复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，仅通过crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性相组合杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过独立于噬菌体的裂解活性的crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，crispr-cas系统的活性补充或增强噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性和crispr-cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性、crispr-cas系统的活性或噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性两者均受噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，噬菌体感染多种细菌菌株。在一些实施方案中，靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。在一些实施方案中，所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。在一些实施方案中，通过溶原性基因的去除、替换或失活而使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。在一些实施方案中，核酸序列插入在非必需噬菌体基因处或与非必需噬菌体基因相邻。在一些实施方案中，细菌细胞的混合群体包含靶细菌。
5.在一些实施方案中，本文公开了一种在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。在一些实施方案中，crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、
gyra或metk。在一些实施方案中，cascade复合物包含i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的cascade多肽。在一些实施方案中，cascade复合物包括：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，cascade复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，仅通过crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性相组合杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过独立于噬菌体的裂解活性的crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，crispr-cas系统的活性补充或增强噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性和crispr-cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性、crispr-cas系统的活性或噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性两者均受噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，噬菌体感染多种细菌菌株。在一些实施方案中，噬菌体是专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。在一些实施方案中，通过溶原性基因的去除、替换或失活而使温和噬菌体裂解性。在一些实施方案中，噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。在一些实施方案中，核酸序列插入在非必需噬菌体基因处或与非必需噬菌体基因相邻。在一些实施方案中，疾病是细菌感染。在一些实施方案中，引起疾病的靶细菌是对至少一种抗生素具有抗性的耐药细菌。在一些实施方案中，耐药细菌对至少一种抗生素具有抗性。在一些实施方案中，引起疾病的靶细菌是多重耐药细菌。在一些实施方案中，多重耐药细菌对至少一种抗生素具有抗性。在一些实施方案中，抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素或甲氧西林。在一些实施方案中，引起细菌感染的靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。在一些实施方案中，引起疾病的靶细菌是假单胞菌属。在一些实施方案中，引起疾病的靶细菌是铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)。在一些实施方案中，施用是动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮下、吸入或其任何组合。在一些实施方案中，个体是哺乳动物。
6.在一些实施方案中，本文公开了包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：crispr阵列；包含cas5、cas8c和cas7的cascade多肽；和
cas3多肽。在一些实施方案中，crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含编码序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，仅通过噬菌体的裂解活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，仅通过crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性相组合杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过独立于噬菌体的裂解活性的crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，crispr-cas系统的活性补充或增强噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性和crispr-cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性、crispr-cas系统的活性或噬菌体的裂解活性与crispr-cas系统的活性两者均受噬菌体的浓度调节。在一些实施方案中，噬菌体感染多种细菌菌株。在一些实施方案中，靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。在一些实施方案中，所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。在一些实施方案中，通过溶原性基因的去除、替换或失活而使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。在一些实施方案中，核酸序列插入非必需噬菌体基因中。在一些实施方案中，本文公开了一种药物组合物，其包含：(a)本文公开的噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物呈片剂、液体剂、糖浆剂、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼用制剂、耳用制剂、皮下制剂、可吸入性呼吸制剂、栓剂和其任何组合的形式。
7.在一些实施方案中，本文公开了一种对有需要的表面进行消毒的方法，所述方法包括向所述表面施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(d)crispr阵列；(e)cascade多肽；和(f)cas3多肽。在一些实施方案中，表面是医院表面、交通工具表面、设备表面或工业表面。
8.在一些实施方案中，本文公开了一种防止食品或营养补充剂污染的方法，所述方法包括向食品或营养补充剂施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。在一些实施方案中，食品或营养补充剂包括奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于奶的发酵产品、冰淇淋、基
于发酵谷物的产品、基于奶的粉末、婴儿配方食品或片剂、液体悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管喂养物(dry-tube-feeding)。
附图说明
9.本公开的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，可以更好地理解本公开的特征和优点，在所述附图中：
10.图1a描述了cr阵列2的序列和排列。图1b描述了cr阵列3的序列和排列。图1c描述了cr阵列3的序列和排列。图1d描述了cr阵列4的序列和排列。图1e描述了cr阵列5的序列和排列。
11.图2a(顶部子图)描绘了使用内源性crispr-cas3系统用含有crrna的质粒转化两个铜绿假单胞菌菌株的效果，通过菌落形成单位(cfu)衡量转化体数量。底部子图显示了用包含含有3个间隔序列的crrna和外源性i-c型cas操纵子的质粒转化铜绿假单胞菌的效果，这导致转化体少于检测限。图2b描绘了转化到铜绿假单胞菌菌株b1121的cas操纵子无效突变体中所获得的每ml细菌转化体的数量。阵列1靶向细菌基因组，而阵列2是非靶向性对照。将不同的质粒通过摩尔浓度标准化为空载体对照质粒。图2c描绘了将靶向rpob或ftsa的单个间隔序列或3-间隔序列阵列阵列3或阵列4转化到具有(b1121)或不具有(b1121 cas ko)内源性i-c型cas操纵子的铜绿假单胞菌菌株中的效果。
12.图3a描绘了野生型噬菌体p1772及其工程化变体的基因组的示意图。基因组轴下方的条形表示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图说明了用于替换缺失区域中wt噬菌体基因的dna。阵列1、阵列3和阵列4靶向细菌基因组，并在i-c型cas操纵子存在的情况下杀伤细菌。阵列2中的间隔序列是非靶向的，但所述阵列在结构上与三个靶向性阵列相同。图3b比较了p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)在37摄氏度下传代5或10次后的序列。在核苷酸水平在插入片段中没有观察到差异，表明表达crispr-cas3的工程化噬菌体的稳定性。
13.图4举例说明了用crispr-cas3工程化的噬菌体不表现出结构变化。当通过tem成像时，p1772wt(野生型)、p1772e004(仅cas系统)和p1772e005(靶向性cr阵列+cas系统)之间没有总体形态差异。
14.图5a-图5c举例说明了完整构建体噬菌体在不同cas类型的变体中与野生型亲本噬菌体相似地扩增，并保留了相似的宿主范围。图5a描绘了在含有i-f型cas系统的铜绿假单胞菌菌株中p1772wt(野生型)、p1772e004(cas系统)和p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)的体外扩增滴度。图5b描绘了在含有i-c型cas系统的铜绿假单胞菌菌株中p1772wt和p1772e005的体外扩增滴度。图5c描绘了在44个铜绿假单胞菌菌株上p1772wt、p1772e004和p1772e005的宿主范围。如果(存在噬菌体时的auc)/(不存在噬菌体时的auc)小于0.65，则认为噬菌体感染给定菌株。
15.图6a-图6e举例说明了外源性crispr-cas3系统从噬菌体基因组有效表达。图6a描绘了插入p1772的工程化变体中的间隔序列阵列和cas操纵子的示意图。图6b-6d描绘了在p1772wt(野生型)或p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)感染1600分钟的铜绿假单胞菌菌株b1121中cr阵列、cas3和cas8的表达。图6e描绘了在感染p1772e005、p2131e002(靶向性cr
阵列1+cas系统)和p2132e002(靶向性cr阵列1+cas系统)后1小时和24小时cas3的表达。
16.图7描绘了将p1772wt(野生型)或p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)平板接种到铜绿假单胞菌上产生的菌斑。
17.图8a举例说明了基于平板接种的杀伤测定的结果。将p1772wt(野生型)、p1772e004(仅cas系统)、p1772e006(仅靶向性cr阵列1)和p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)以感染复数(moi)100到0.0000954与铜绿假单胞菌混合。图8b以更大的放大率描绘了如图8a中设置的板的部分。图8c显示了p1772wt、p1772e008(非靶向性cr阵列2+cas系统)、p1772e006和p1772e005以moi 1.5感染的铜绿假单胞菌的相对荧光单位的定量
18.图9a描绘了p1772wt(野生型)、p1772e004(仅cas系统)、p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)和p1772e006(仅靶向性cr阵列1)以moi 1接种在铜绿假单胞菌菌株b1121中经24小时的生长。图9b描绘了p1772wt、p1772e004、p1772e005和p1772e006以moi 10接种在铜绿假单胞菌菌株b1121中经24小时的生长。图9c描绘了p1772wt、p1772e004、p1772e005和p1772e006以moi 100接种在铜绿假单胞菌菌株b1121中经24小时的生长。
19.图10a描绘了与p1772wt(野生型)、p1772e008(非靶向性cr阵列2+cas系统)、p1772e006(仅靶向性cr阵列1)和p阵列3(靶向性cr阵列3+cas系统)以moi从100到0.0001混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上的生长。图10b描绘了与p1772wt、p1772e008、p1772e006和p阵列4(靶向性cr阵列4+cas系统)以moi从100到0.0001混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上的生长。图10c是图10a的插图并且描绘了p1772e006与p阵列3相比在moi为0.0244(顶行)和0.00610(底行)时的放大。图10d是图10a中以约1.5的moi感染噬菌体后来自细菌的荧光信号的定量。图10e是图10b中以约1.5的moi感染噬菌体后来自细菌的荧光信号的定量。
20.图11描述了与具有不同启动子的p1772变体混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上的生长。图11a显示了与p1772wt(野生型)和含有相同cr阵列1和cas系统的变体以moi从100到0.00001混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上的生长，其中cas系统由不同的启动子驱动。图11b显示了来自图11a的在moi 1.5时细胞的荧光的定量。
21.图12a描述了与p2132wt(野生型)和p2132e002(靶向性cr阵列1+cas系统)以moi为1.5混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上生长的荧光的定量。图12b描述了与p2973wt(野生型)和p2973e002(靶向性cr阵列1+cas系统)以moi为1.5混合的铜绿假单胞菌培养物在琼脂板上生长的荧光的定量。
22.图13描绘了混合不同噬菌体变体的铜绿假单胞菌培养物的不同菌株在琼脂板上的生长。将p4209wt(野生型)和p4209e002(靶向性cr阵列1+cas系统)与铜绿假单胞菌的b2550(i-e型cas)、b2631(i-f型cas)、b2816(i-e/i-f型cas)和b2825(无活性i型cas)菌株混合并在孵育0小时、3小时或24小时后平板接种。
23.图14描述了cr阵列/cas插入片段在多个铜绿假单胞菌菌株中的功效。p4209wt(野生型)、p4209e001(仅cas系统)和p4209e002(靶向性cr阵列1+cas系统)在铜绿假单胞菌的b2550(i-e型cas)、b2631(i-f型cas)、b2816(i-e/i-f型cas)和b2825(无活性i型cas)菌株上进行成斑。
24.图15a-图15d举例说明了将p1772wt(野生型)与p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)进行比较的体内功效结果。图15a是描绘图15b-15d的实验设置的示意图。图15b描绘了
当注射到小鼠大腿肌肉中时噬菌体的功效。左子图描绘了在感染后6小时回收的菌落形成单位(cfu)的数量。右子图描绘了在感染后6小时回收的噬菌斑形成单位(pfu)的数量。图15c描绘了当注射到小鼠大腿肌肉中时噬菌体的功效，并描绘了在感染后8小时和24小时回收的cfu(上图)和pfu(下图)的数量。图15d描绘了静脉内施用时噬菌体的功效，并描绘了感染后9、12、15和24小时回收的cfu(上图)和pfu(下图)的数量。图15e描绘了图15f的实验设置。图15f描绘了用p1772wt和p1772e005处理的剂量响应，并描绘了感染后8小时和24小时回收的cfu(上图)和pfu(下图)的量。数据显示为平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。多重比较与单向anova，或tukey检验与双向anova。
25.图16是野生型噬菌体p004k及其工程化变体p004ke007的基因组示意图。基因组轴下方的条形表示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图说明了用于替换缺失区域中wt噬菌体基因的dna。
26.图17说明了cr阵列/cas系统插入物在大肠杆菌中的功效。图17a描绘了p004kwt(野生型)和p004ke007(cr阵列5+cas系统)与三种大肠杆菌菌株(b3402、b3418或b4098)混合在琼脂板上的生长。图17b-图17d分别是b3402、b3418和b4098中细胞生长的光密度的定量。
27.图18举例说明了crispr-cas3工程化参考噬菌体pb1e002(cr阵列1+cas系统)与p1772e005(cr阵列1+cas系统)协同作用。
28.图19描绘了在用含有不同间隔序列的插入物转染假单胞菌后产生的转化体的数量。
具体实施方式
29.在某些实施方案中，本文公开了包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列(也称为“cr阵列”)；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。此外，在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含如本文公开的噬菌体。在某些实施方案中，本文进一步公开了杀伤靶细菌的方法，所述方法包括将包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体引入靶细菌中，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。在某些实施方案中，本文进一步公开了在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。某些术语
30.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文的公开内容的描述中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而无意于限制本公开内容。
31.除非上下文另有说明，否则特别地本文描述的本公开内容的各种特征旨在能够以任何组合使用。此外，本公开内容还考虑在一些实施方案中，排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。举例说明，如果说明书指出组合物包含组分a、b和c，则明确表示单独地或以任何组合省略或放弃a、b或c或其组合中的任何一项。
32.本领域技术人员将理解，由于文献中缺乏一致性以及本领域中为统一这种术语所
做出的不断努力，指定各种crispr-cas系统及其组分的术语具有可互换性。
33.如说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”、“一个(种)”和“该(所述)”也旨在包括复数形式。同样如本文中所使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以替代方式(“或”)解释时所缺乏的组合。
34.当提及可测量值如剂量或时间段及诸如此类时，本文所使用的术语“约”是指指定量的
±
20％、
±
10％、
±
5％、
±
1％、+0.5％或甚至
±
0.1％的变化。如本文所用，短语如“在x与y之间”和“在约x与y之间”应解释为包括x和y。如本文所使用，短语如“在约x与y之间”意指“在约x与约y之间”，短语如“约x至y”意指“约x至约y”。
35.本文所用的术语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包含(includes)”、“包含(including)”和“具有(have)”指定存在所述特征、步骤、操作、元件和/或组分、但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、元件、组分和/或其组合的存在或加入。
36.如本文所用，过渡性短语“基本上由
……
组成”是指权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的指定材料或步骤以及不实质性地影响要求保护的公开内容的基本特征和新颖特征的材料或步骤。因此，当在本公开内容的权利要求书中使用时，术语“基本上由
……
组成”不旨在解释为等同于“包括”。
37.如本文中所使用的，术语“由
……
组成(consists of)”和“由
……
组成(consisting of)”排除了没有以其他方式直接陈述的任何特征、步骤、操作、元件和/或组分。“由
……
组成”的使用仅限制该条款中阐述的特征、步骤、操作、元件和/或组分，并且的确从权利要求整体上排除了其他特征、步骤、操作、元件和/或组分。
38.如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指在允许的盐和温度条件下通过碱基配对多核苷酸的天然结合。例如，序列“a-g-t”与互补序列“t-c-a”结合。两个单链分子之间的互补性是“部分的”，其中仅某些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有重要影响。
39.如本文所用，“互补”是指与比较核苷酸序列具有100％的互补性或同一性，或者它是指小于100％的互补性(例如约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等互补性)。互补或可互补也可关于突变的“互补(complement)”或“互补(complementing)”使用。
40.如本文所用，术语“crispr噬菌体”、“crispr增强型噬菌体”和“cr噬菌体”是指包含噬菌体dna的噬菌体颗粒，所述噬菌体dna包含编码crispr-cas系统的至少一种组分的至少一种异源多核苷酸(例如，crispr阵列，crrna；例如，包含靶向性crrna插入的p1噬菌体)。在一些实施方案中，多核苷酸编码crispr-cas系统的至少一种转录激活剂。在一些实施方案中，多核苷酸编码crispr-cas系统的抗crispr多肽的至少一种组分。
41.如本文所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或蛋白质序列的上下文中，短语“基本相同”或“基本同一性”是指当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查测量进行比较和比对以获得最大对应时具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和/或100％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列。在一些实施方案中，基本同一性是指两个或更多个序列或子序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、96％、96％、97％、98％或99％同一性。对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数来计算(一个或多个)测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
42.用于比对比较窗口的序列的最佳比对通过工具诸如smith和waterman的局部同源性算法，needleman和wunsch的同源性比对算法，pearson和lipman的搜索相似性方法来进行，并且任选地通过这些算法的计算机化实施，例如gap、bestfit、fasta和tfasta，可作为wisconsin(accelrys inc.，san diego，ca)的部分获得。用于测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是由两个比对序列共有的相同组分的数量除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列是与全长多核苷酸序列或其部分，或与更长的多核苷酸序列进行比较。在一些情况下，使用针对翻译的核苷酸序列的blastx 2.0版本和针对多核苷酸序列的blastn 2.0版本来确定“同一性百分比”。
43.如本文所用，“靶核苷酸序列”是指靶基因的部分(即基因组中的靶区域或与前间隔序列相邻基序(pam)序列相邻的“前间隔序列”)，其与crispr阵列中的间隔序列完全互补或基本上互补(例如，至少70％互补(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更多))。
44.如本文所用，术语“前间隔序列相邻基序”或“pam”是指靶dna分子上存在的与匹配间隔序列的核苷酸序列相邻的dna序列。该基序存在于与间隔序列由于互补而结合的区域相邻的靶基因中，并鉴定与间隔核苷酸序列开始碱基配对所在的点。所需的确切pam序列因每个不同的crispr-cas系统而异。pam的非限制性示例包括cca、cct、ccg、ttc、aag、agg、atg、gag和/或cc。在某些情况下，在i型系统中，pam紧邻位于与间隔序列匹配的序列的5'，因此位于与间隔核苷酸序列碱基配对的序列的3'，并且直接被cascade识别。在一些情况下，对于耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)i-c型系统，pam是yyc，其中y可以是t或c。在某些情况下，对于铜绿假单胞菌i-c型系统，pam是ttc。一旦同源前间隔序列和pam被识别，cas3is就会被募集，其然后切割并降解靶dna。对于ii型系统，cas9/sgrna需要pam来形成r环以通过其指导rna与基因组的watson-crick配对来探询特定dna序列。pam特异性随cas9蛋白(例如，cas9的c末端的“前间隔序列相邻基序识别结构域”)的dna结合特异性而变化。
45.如本文所用，术语“基因”是指能够用于产生mrna、trna、rrna、mirna、抗微小rna、调节性rna等的核酸分子。基因可以能用于或可以不能用于产生功能性蛋白质或基因产物。基因包括编码区和非编码区(例如内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。“分离的”基因是指基本上或大体上不含通常发现的与其天然状态的核酸缔合的组分的核酸。这样的组分包括其他细胞材料、来自重组生产的培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学品。
46.通过术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”旨在减轻或至
少部分改善或改变对象的病症的严重性，并且实现至少一种临床症状的一些缓解、缓和或减轻，和/或疾病或病症的进展延迟，和/或疾病或病症的发作延迟。关于感染、疾病或病症，该术语是指感染、疾病或病症的症状或其他表现的减轻。在一些实施方案中，治疗使感染、疾病或病症的症状或其他表现减少至少约5％，例如约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。
47.术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”(及其语法变体)是指预防和/或延迟对象的感染、疾病、病症和/或临床症状的发作，并且/或相对于在疾病、病症和/或临床症状发作之前不实施本文公开的方法时会发生的情况，感染、疾病、病症和/或临床症状发作的严重性降低。因此，在一些实施方案中，为了预防感染，用本文公开的组合物和方法处理食物、表面、医疗工具和装置。
48.本文使用的关于“感染”、“疾病”或“病症”的术语是指对象中的任何不利的、负面的或有害的生理状况。在一些实施方案中，“感染”、“疾病”或“病症”的来源是靶细菌群体在对象中和/或对象上的存在。在一些实施方案中，细菌群体包含一种或多种靶细菌物种。在一些实施方案中，细菌群体中的一种或多种细菌物种包括一种或多种细菌的一种或多种菌株。在一些实施方案中，靶细菌群体引起急性或慢性的“感染”、“疾病”或“病症”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起局部或全身的“感染”、“疾病”或“病症”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起特发性“感染”、“疾病”或“病症”。在一些实施方案中，靶细菌群体引起通过以下方式获得的“感染”、“疾病”或“病症”，所述方式包括但不限于呼吸吸入、摄食、皮肤和伤口感染、血流感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、尿路感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、腹内感染、表皮或粘膜吸收、眼部感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化感染、留置式医疗器械(如关节假体)的感染、种植牙、导管和心脏植入物、性接触、和/或医院获得性和呼吸机相关的细菌性肺炎。
49.如本文所用，术语“个体”或“对象”包括患有或易患涉及细菌的感染、疾病或病症的任何动物。因此，在一些实施方案中，对象是哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、甲壳动物或软体动物。哺乳动物对象包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如，大猩猩、猴、狒狒和黑猩猩等)、狗、猫、山羊、马、猪、牛、羊等，以及实验室动物(例如，大鼠、豚鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠等)。鸟类对象包括但不限于鸡、鸭、火鸡、鹅、鹌鹑、野鸡和作为宠物饲养的鸟(例如，长尾小鹦鹉、鹦鹉、金刚鹦鹉、凤头鹦鹉、金丝雀等)。鱼对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如金枪鱼、鲑鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳟鱼、鳕鱼、海鲈鱼、河鲈鱼、鲷鱼等)。甲壳动物对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如虾、对虾、龙虾、小龙虾、螃蟹等)。软体动物对象包括但不限于水产养殖中使用的物种(例如鲍鱼、贻贝、牡蛎、蛤蜊、扇贝等)。在一些实施方案中，合适的对象包括雄性和雌性以及任何年龄的对象，包括胚胎(例如，子宫内或卵内)、婴儿、幼年期、青春期、成年期和老年期对象。在一些实施方案中，对象是人。
50.如本文所用，在核酸序列上下文中，术语“分离的”是从其天然环境中分开存在的核酸序列。
51.如本文所使用的，“表达盒”意指包含目的核苷酸序列(例如，本文公开的重组核酸分子和crispr阵列)的重组核酸分子，其中该核苷酸序列与至少一个控制序列(例如，启动子)可操作地关联。
52.如本文所用，“嵌合”是指其中至少两种组分源自不同来源(例如，不同生物体、不同编码区)的核酸分子或多肽。
53.如本文所使用的，“可选择性标记”意指如下核苷酸序列，当该核苷酸序列表达时向表达该标记的宿主细胞赋予不同的表型，并且因此允许此类转化的细胞与不具有该标记的那些区别开来。
54.如本文所用，“载体”是指用于将一个核酸(或多个核酸)转移、递送或引入细胞中的组合物。
55.如本文所用，“药学上可接受的”是指在生物学或其他方面不是不合需要的材料，即，将材料施用于对象而不引起任何不合需要的生物学效应例如毒性。
56.如本文所用，术语“生物膜”是指嵌入多糖基质中的微生物的积累。生物膜在固体生物或非生物表面上形成，并且在医学上是重要的，占体内微生物感染的超过80％。
57.如本文所用，术语“体内”用于描述在对象体内发生的事件。
58.如本文所用，术语“体外”用于描述在用于容纳实验室试剂的容器中发生的事件，以便将它与从中获得材料的生物源分离。体外测定可以包括其中使用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定还可以包括其中不使用完整细胞的无细胞测定。crispr/cas系统
59.crispr-cas系统是在细菌和古细菌中发现的自然适应性免疫系统。crispr系统是一种核酸酶系统，参与防御入侵的噬菌体和质粒，提供获得性免疫的形式。基于cas基因集合及其系统发育关系，存在crispr-cas系统的多样性。存在至少六种不同的类型(i到vi)，其中i型代表细菌和古细菌中所有已鉴定的系统的超过50％。在一些实施方案中，本文使用i型、ii型、ii型、iv型、v型或vi型crispr-cas系统。
60.i型系统分为七种亚型，包括：i-a型、i-b型、i-c型、i-d型、i-e型、i-f型和i-u型。i型crispr-cas系统包括称为cascade的多亚单位复合物(与抗病毒防御相关的复合物)、cas3(一种具有核酸酶、解旋酶和核酸外切酶活性的蛋白质，负责降解靶dna)和编码crrna的crispr阵列(稳定化cascade复合物并将cascade和cas3引导至dna靶标)。cascade与crrna形成复合物，蛋白质-rna对通过crrna序列的5’末端和预定义的前间隔序列之间的互补碱基配对来识别其基因组靶标。该复合物通过在病原体基因组内的crrna和前间隔序列相邻基序(pam)内编码的区域而被定向于病原体dna的同源基因座。碱基配对发生在crrna和靶dna序列之间，导致构象变化。在i-e型系统中，pam被cascade中的casa蛋白识别，其然后解开侧翼dna以评估靶标和crrna的间隔序列部分之间的碱基配对程度。充分的识别导致cascade募集和激活cas3。然后cas3切口非靶链并开始以3'到5'的方向降解该链。
61.在i-c型系统中，cas5、cas8c和cas7蛋白形成cascade效应复合物。cas5处理前crrna(可以采用多间隔序列阵列的形式，或两个重复序列之间的单间隔序列)以产生由剩余重复序列和线性间隔序列形成的发夹结构构成的(一个或多个)单独crrna。然后，效应复合物与处理后的crrna结合并扫描dna以鉴定pam位点。在i-c型系统中，pam被cas8c蛋白识别，然后起到解开dna双链体的作用。如果pam的3’序列匹配与效应复合物结合的crrna间隔序列，则复合物的构象发生变化，并且cas3被募集到该位点。然后cas3切口非靶链并开始降解dna。
62.在一些实施方案中，crispr-cas系统对于靶细菌是内源的。在一些实施方案中，
crispr-cas系统对于靶细菌是外源的。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-a型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-b型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-c型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是源自铜绿假单胞菌的i-c型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-d型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-e型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-f型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i-u型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是ii型crispr-cas系统。在一些实施方案中，crispr-cas系统是iii型crispr-cas系统。
63.在一些实施方案中，本文公开的crispr阵列的加工包括但不限于以下过程：1)编码前crrna的核酸的转录；2)cascade和/或cascade的特定成员，例如cas6对前crrna的识别，和(3)cascade或cascade的成员，例如cas6，将前crrna加工成成熟的crrna。在一些实施方案中，i型crispr系统的作用模式包括但不限于以下过程：4)成熟crrna与cascade复合；5)复合的成熟crrna/cascade复合物对靶标识别；和6)靶标处的核酸酶活性导致dna降解。crispr噬菌体
64.在某些实施方案中，本文公开了包含crispr-cas系统的噬菌体组合物及其使用方法。
65.噬菌体(bacteriophage)或“噬菌体(phage)”代表一组细菌病毒并且是从环境来源中工程化或来源于环境来源。单个噬菌体宿主范围通常窄，这意味着噬菌体对细菌物种的一种菌株或少数几种菌株具有高度特异性，并且这种特异性使其在抗细菌作用方面具有独特性。噬菌体是依赖宿主细胞机构进行复制的细菌病毒。根据其生活方式，噬菌体通常分为烈性噬菌体或温和噬菌体。烈性噬菌体，也称为裂解性噬菌体，只能进行裂解性复制。裂解性噬菌体感染宿主细胞，经历多轮复制，并触发细胞裂解以释放新制造的噬菌体颗粒。在一些实施方案中，本文公开的裂解性噬菌体保留其复制能力。在一些实施方案中，本文公开的裂解性噬菌体保留其触发细胞裂解的能力。在一些实施方案中，本文公开的裂解性噬菌体保留其复制能力和触发细胞裂解的能力。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体包含crispr阵列。在一些实施方案中，crispr阵列不影响噬菌体复制和/或触发细胞裂解的能力。温和噬菌体或溶原性噬菌体可以经历溶原性，其中噬菌体停止复制并稳定地驻留在宿主细胞内，要么整合入细菌基因组中，要么作为染色体外质粒维持。温和噬菌体也可以进行裂解性复制，类似于它们的裂解性噬菌体对应物。在感染时温和噬菌体是裂解性复制还是发生溶原性取决于各种因素，包括生长条件和细胞的生理状态。将溶原性噬菌体整合到其基因组中的细菌细胞称为溶原性细菌或溶原菌。暴露于不利条件可能触发溶原性噬菌体的重新激活、溶原性状态的终止和噬菌体的裂解性复制的恢复。这个过程称为诱导。有利于溶原性状态终止的不利条件包括干燥、暴露于uv或电离辐射以及暴露于诱变化学品。这导致噬菌体基因的表达、整合过程的逆转和裂解性增殖。在一些实施方案中，本文公开的是获得裂解性的温和噬菌体。术语“溶原性基因”是指其基因产物促进温和噬菌体溶原性的任何基因。溶原性基因可以直接促进溶原性，如促进噬菌体整合入宿主基因组中的整合酶蛋白的情况中。溶原性基因也可以间接促进溶原性，如在ci转录调节物(其阻止裂解性复制所需基因的转录并且从而有利于维持溶原性)的情况中。
66.噬菌体使用三种通用方法来包装和递送合成的dna。在第一种方法下，合成的dna以靶向方式重组到噬菌体基因组中，这通常涉及可选择性标记。在第二种方法下，噬菌体内的限制性位点用于在体外引入合成的dna。在第三种方法下，通常编码噬菌体包装位点和裂解性复制起点的质粒被包装为噬菌体颗粒的组装体的部分。所得的质粒被称为“噬菌粒”。
67.出于进化的原因，噬菌体限于给定的细菌菌株。在某些情况下，将它们的遗传物质注入不相容的菌株中会适得其反。因此，噬菌体已进化为特异性地感染有限的典型细菌菌株。然而，已经发现一些噬菌体将它们的遗传物质注入到多种细菌中。典型的示例是p1噬菌体，它已显示将dna注入一系列革兰氏阴性细菌中。
68.在一些实施方案中，本文公开了噬菌体，其包含编码第一间隔序列或从其转录的crrna的第一核酸序列，其中所述第一间隔序列与来自靶细菌中的靶基因的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，噬菌体包含编码第一间隔序列或从其转录的crrna的第一核酸序列，其中所述第一间隔序列与来自靶细菌中的靶基因的靶核苷酸序列互补，前提是使所述噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体是温和噬菌体。在一些实施方案中，通过溶原性基因的去除、替换或失活而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，溶原性基因在维持噬菌体中的溶原周期中起作用。在一些实施方案中，溶原性基因在噬菌体中建立溶原周期中起作用。在一些实施方案中，溶原性基因在噬菌体中的溶原周期的建立和溶原周期的维持中都起作用。在一些实施方案中，溶原性基因是阻遏基因。在一些实施方案中，溶原性基因是ci阻遏基因。在一些实施方案中，通过去除溶原性基因的调节元件而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过去除溶原性基因的启动子而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过去除溶原性基因的功能元件而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，溶原性基因是激活基因。在一些实施方案中，溶原性基因是cii基因。在一些实施方案中，溶原性基因是lexa基因。在一些实施方案中，溶原性基因是int(整合酶)基因。在一些实施方案中，去除、替换或灭活两个或更多个溶原性基因以引起噬菌体溶原周期的停滞和/或裂解周期的诱导。在一些实施方案中，通过包含定向于溶原性基因的第二间隔序列的第二crispr阵列而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过插入一种或多种裂解性基因而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过插入一种或多种有助于诱导裂解周期的基因而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过改变一种或多种有助于诱导裂解周期的基因的表达来使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体在表型上从溶原性噬菌体变为裂解性噬菌体。在一些实施方案中，表型变化是通过自靶向性crispr-cas系统以使噬菌体获得裂解性，因为它不具有溶原性。在一些实施方案中，自靶向性crispr-cas包含来自原噬菌体基因组的自靶向性crrna并杀伤溶原菌。在一些实施方案中，噬菌体因环境改变而获得裂解性。在一些实施方案中，环境改变包括但不限于温度、ph或营养物的改变，暴露于抗生素、过氧化氢、外源性dna或dna损伤剂，有机碳的存在和重金属(例如，铬(vi)的形式的重金属)的存在。在一些实施方案中，防止获得裂解性的噬菌体回复到溶原性状态。在一些实施方案中，通过引入另外的cripsr阵列来防止获得裂解性的噬菌体回复到溶原性状态。在一些实施方案中，除了由噬菌体的裂解活性和/或crispr阵列的活性引起的细胞死亡之外，噬菌体不赋予靶细菌任何新的特性。在一些实施方案中，本文进一步公开了温和噬菌体，其包含编码第一间隔序列或从其转录的crrna的第一核酸序列，其中所述第一间隔序列与来自靶细菌中的靶基因的靶核苷酸序列互补，前提是使所述噬菌体获得裂解性。在一些
实施方案中，噬菌体感染多种细菌菌株。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶基因的启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于靶基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶细菌存活所需的必需基因的至少一部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。在一些实施方案中，靶核苷酸序列在非必需基因中。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非编码序列。在一些实施方案中，非编码序列是基因间序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中高度保守序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中存在的序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔序列与包含必需基因的启动子序列的全部或部分的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，第一核酸序列包括包含至少一个重复序列的第一crispr阵列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至第一间隔序列。在一些实施方案中，靶细菌是艰难梭菌。
69.在一些实施方案中，噬菌体或噬菌粒dna来自溶原性噬菌体或温和噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体或噬菌粒包括但不限于p1噬菌体、m13噬菌体、λ噬菌体、t4噬菌体、t7噬菌体、t7m噬菌体、φc2噬菌体、φcd27噬菌体、φnm1噬菌体、bc431 v3噬菌体、φ10噬菌体、φ25噬菌体、φ151噬菌体、a511样噬菌体、b054、0176样噬菌体或弯曲杆菌噬菌体(例如nctc 12676和nctc 12677)。在一些实施方案中，噬菌体是φcd146艰难梭菌噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是φcd24-2艰难梭菌噬菌体。
70.在一些实施方案中，多种噬菌体一起使用。在一些实施方案中，一起使用的多种噬菌体靶向样品或对象中的相同或不同细菌。在一些实施方案中，一起使用的噬菌体包括t4噬菌体、t7噬菌体、t7m噬菌体或本文所述的噬菌体的任何组合。
71.在一些实施方案中，目的噬菌体获自环境来源或商业研究供应商。在一些实施方案中，针对细菌及其相关菌株文库的裂解活性筛选获得的噬菌体。在一些实施方案中，针对细菌及其相关菌株文库在筛选的细菌中产生初级抗性的能力来筛选噬菌体。
72.在一些实施方案中，核酸插入到噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸包括cr阵列、cas系统或其组合。在一些实施方案中，核酸插入噬菌体基因组中目的操纵子末端的转录终止子位点处。在一些实施方案中，核酸插入噬菌体基因组中作为一种或多种去除的非必需基因的替代物。在一些实施方案中，核酸插入噬菌体基因组中作为一种或多种去除的溶原性基因的替代物。在一些实施方案中，用核酸替代非必需和/或溶原性基因增强了噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸替代非必需和/或溶原性基因使溶原性噬菌体获得裂解性。
73.在一些实施方案中，核酸被引入噬菌体基因组中在第一位置，而一个或多个非必需和/或溶原性基因从噬菌体基因组中的不同位置被分别去除和/或失活。在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的去除使溶原性噬菌体变成裂解性噬菌体。类似地，在一些实施方案中，将一种或多种裂解性基因引入噬菌体中以使非裂解性的溶原性噬菌体成为裂解性噬菌体。
74.在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的替换、去除、失活或其任何组合通过化学、生物化学和/或任何合适的方法实现。在一些实施方案中，一种或多种
裂解性基因的插入通过任何合适的化学、生物化学和/或物理方法通过同源重组来实现。
75.在一些实施方案中，噬菌体是φcd146艰难梭菌噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是φcd24-2艰难梭菌噬菌体。
76.在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是对于噬菌体的存活而言非必需的基因。在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是对于诱导和/或维持裂解周期而言非必需的基因。在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是来自φcd146艰难梭菌噬菌体的gp49。在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是来自φcd24-2艰难梭菌噬菌体的gp75。
77.在某些实施方案中，本文公开了包含完整的外源性crispr-cas系统的噬菌体。在一些实施方案中，crispr-cas系统是i型crispr-cas系统、ii型crispr-cas系统、iii型crispr-cas系统、iv型crispr-cas系统、v型crispr-cas系统或vi型crispr-cas系统。在某些实施方案中，本文公开了包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。crispr阵列
78.在一些实施方案中，crispr阵列(cr阵列)包含间隔序列和至少一个重复序列。在一些实施方案中，crispr阵列编码经加工的成熟crrna。在一些实施方案中，将成熟crrna引入噬菌体或靶细菌中。在一些实施方案中，内源性或外源性cas6将crispr阵列加工成成熟crrna。在一些实施方案中，将外源性cas6引入噬菌体中。在一些实施方案中，噬菌体包含外源性cas6。在一些实施方案中，将外源性cas6引入靶细菌中。
79.在一些实施方案中，crispr阵列包含间隔序列。在一些实施方案中，crispr阵列还包含至少一个重复序列。在一些实施方案中，至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至间隔序列。在一些实施方案中，crispr阵列具有任何长度并且包含通过靶向一个或多个必需基因来实现靶细菌的所需杀伤水平所必需的与重复核苷酸序列交替的任何数量的间隔核苷酸序列。在一些实施方案中，crispr阵列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：1至约100个间隔核苷酸序列，每个间隔核苷酸序列在其5’末端和其3'末端连接至重复核苷酸序列。在一些实施方案中，crispr阵列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个间隔核苷酸序列。间隔序列
80.在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是编码区。在一些实施方案中，编码区是必需基因。在一些实施方案中，编码区是非必需基因。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非编码序列。在一些实施方案中，非编码序列是基因间序列。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中高度保守序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔序列与靶细菌中存在的序列的靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，间隔序列与包含必需基因的启动子序列的全部或部分的靶核苷酸序列
互补。在一些实施方案中，与靶核苷酸序列相比，间隔序列包含一个、两个、三个、四个或五个错配。在一些实施方案中，错配是连续的。在一些实施方案中，错配是不连续的。在一些实施方案中，间隔序列与靶核苷酸序列具有70％互补性。在一些实施方案中，间隔序列与靶核苷酸序列具有80％互补性。在一些实施方案中，间隔序列与靶核苷酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补性。在一些实施方案中，间隔序列与靶核苷酸序列具有100％互补性。在一些实施方案中，间隔序列在靶核苷酸序列的长度为至少约8个核苷酸至约150个核苷酸的区域上具有完全互补性或基本互补性。在一些实施方案中，间隔序列在靶核苷酸序列的长度为至少约20个核苷酸至约100个核苷酸的区域上具有完全互补性或基本互补性。在一些实施方案中，间隔序列的5'区与靶核苷酸序列100％互补，而间隔序列的3'区与靶核苷酸序列基本上互补，因此间隔序列与靶核苷酸序列的总体互补性小于100％。例如，在一些实施方案中，具有20个核苷酸的间隔序列(种子区)的3'区中的前7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔序列的5'区中的剩余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔序列的3'末端的前7至12个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔序列的5'区中的剩余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约50％互补(例如，50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多))。在一些实施方案中，间隔序列的3’末端的前7至10个核苷酸与靶核苷酸序列75％-99％互补，而间隔序列的5'区的其余核苷酸与靶核苷酸序列至少约50％至约99％互补。在一些实施方案中，间隔序列的3'末端的前7至10个核苷酸与靶核苷酸序列100％互补，而间隔序列的5'区中的剩余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔序列的前10个核苷酸(在种子区内)与靶核苷酸序列100％互补，而间隔序列的5'区中的剩余核苷酸与靶核苷酸序列基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施方案中，间隔序列的5'区(例如，在5'末端的前8个核苷酸、在5'末端的前10个核苷酸、在5'末端的前15个核苷酸、在5'末端的前20个核苷酸)与靶核苷酸序列具有约75％或更多互补性(75％至约100％互补性)，而间隔序列的其余部分与靶核苷酸序列具有约50％或更多互补性。在一些实施方案中，间隔序列的5'末端的前8个核苷酸与靶核苷酸序列具有100％互补性，或具有一个或两个突变并且因此分别与靶核苷酸序列具有约88％互补性或约75％互补性，而间隔核苷酸序列的其余部分与靶核苷酸序列具有至少约50％或更多互补性。
81.在一些实施方案中，间隔序列的长度为约15个核苷酸至约150个核苷酸。在一些实施方案中，间隔核苷酸序列的长度为约15个核苷酸至约100个核苷酸(例如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个核苷酸或者更多)。在一些实施方案中，间隔核苷酸序列的长度为约8至约150个核苷酸、约8至约100个核苷酸、约8至约50个核苷酸、约8至约40个核苷酸、约8至约30个核苷酸、约8至约25个核苷酸、约8至约20个核苷酸、约10至约150个核苷酸、约10至约100个核苷酸、约10至约80个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40、约10至约
30、约10至约25、约10至约20、约15至约150、约15至约100、约15至约50、约15至约40、约15至约30、约20至约150个核苷酸、约20至约100个核苷酸、约20至约80个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约20至约40、约20至约30、约20至约25、至少约8、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约32、至少约35、至少约40、至少约44、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150个核苷酸长度或更多，以及其中的任何值或范围。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌i-c型cas系统具有约30至39个核苷酸、约31至约38个核苷酸、约32至约37个核苷酸、约33至约36个核苷酸、约34至约35个核苷酸或约35个核苷酸的间隔序列长度。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌i-c型cas系统具有约34个核苷酸的间隔序列长度。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌i-c型cas系统具有至少约10、至少约15、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约29、至少约29、至少约30、至少约31、至少约32、至少约33、至少约34、至少约、至少约35、至少约36、至少约37、至少约38、至少约39、至少约20、至少约41、至少约42、至少约43、至少约44、至少约45或多于约45个核苷酸的间隔序列长度。
82.在一些实施方案中，间隔序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，间隔序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约95％同源性。在一些情况下，间隔序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，间隔序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，间隔序列与seq id no:12-22中的任一个具有100％同源性。在一些情况下，间隔序列包含具有seq id no:12-22中任一个的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或多于34个核苷酸的至少一部分。
83.术语“序列同一性”是指两个多核苷酸序列在比较窗口内是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。“序列同一性的百分比”是通过以下计算的：比较在比较的窗口上的两个最佳地比对的序列，确定在两个序列中存在的相同的核酸碱基(例如a、t、c、g、u或i)所在的位置的数量，从而产生匹配的位置的数量，将匹配的位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100，从而产生序列同一性的百分比。
84.术语两个蛋白质之间的“同源性”或“相似性”是通过将一个蛋白质序列的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二蛋白质序列比较来确定的。相似性可以通过本领域众所周知的程序来确定，例如，blast程序(美国国家生物技术信息中心的基本局部比对搜索工具)。
85.在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个间隔序列的同一性是相同的。在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个间隔序列的同一性不同。在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个间隔序列的同一性不同但与一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个间隔序列的同一性不同并且与作为重叠序列的一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个间隔序列的同一性不同并且与不是重叠序列的一个或多个靶核苷酸序列互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列的长度为约10至约40个连续核苷酸，其位于与生物体的基因组中的pam序列(pam序列紧邻靶区域的3')紧邻。在一些实施方案中，靶核苷酸序列位于与pam(前间隔序
列相邻基序)相邻或侧接。在一些实施方案中，crispr阵列的两个或更多个序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，crispr阵列的两个或更多个序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约95％同源性。在一些情况下，crispr阵列的两个或更多个序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，crispr阵列的两个或更多个序列与seq id no:12-22中的任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，crispr阵列的两个或更多个序列与seq id no:12-22中的任一个具有100％同源性。在一些情况下，crispr阵列的两个或更多个序列包含具有seq id no:12-22中任一个的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或多于34个核苷酸的至少一部分。
86.在一些实施方案中，crispr阵列包含：第一间隔序列，该第一间隔序列与seq id no:12-15中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第二间隔序列，该第二间隔序列与seq id no:16-18中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第三间隔序列，该第三间隔序列与seq id no:19-21中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其中所述第一间隔序列、第二间隔序列和第三间隔序列包含0-8个核苷酸修饰。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12-15中的任一个具有至少或约97％同源性；第二间隔序列与seq id no:16-18中的任一个具有至少或约97％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:20-23中的任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12-15中的任一个具有至少或约99％同源性；第二间隔序列与seq id no:16-18中的任一个具有至少或约99％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:19-21中的任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12-15中的任一个具有至少或约100％同源性；第二间隔序列与seq id no:16-19中的任一个具有至少或约100％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:19-21中的任一个具有至少或约100％同源性。
87.在一些实施方案中，crispr阵列包含：第一间隔序列，该第一间隔序列与seq id no:12具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第二间隔序列，该第二间隔序列与seq id no:16具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第三间隔序列，该第三间隔序列与seq id no:20具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其中所述第一间隔序列、第二间隔序列和第三间隔序列包含0-8个核苷酸修饰。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12具有至少或约97％同源性；第二间隔序列与seq id no:16具有至少或约97％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:19具有至少或约97％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12具有至少或约99％同源性；第二间隔序列与seq id no:16具有至少或约99％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:19具有至少或约99％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:12具有至少或约100％同源性；第二间隔序列与seq id no:16具有至少或约100％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:19具有
至少或约100％同源性。
88.在一些实施方案中，crispr阵列包含：第一间隔序列，该第一间隔序列与seq id no:13具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第二间隔序列，该第二间隔序列与seq id no:17具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第三间隔序列，该第三间隔序列与seq id no:20具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其中所述第一间隔序列、第二间隔序列和第三间隔序列包含0-8个核苷酸修饰。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:13具有至少或约97％同源性；第二间隔序列与seq id no:17具有至少或约97％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:20具有至少或约97％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:13具有至少或约99％同源性；第二间隔序列与seq id no:17具有至少或约99％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:20具有至少或约99％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:13具有至少或约100％同源性；第二间隔序列与seq id no:17具有至少或约100％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:20具有至少或约100％同源性。
89.在一些实施方案中，crispr阵列包含：第一间隔序列，该第一间隔序列与seq id no:14具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第二间隔序列，该第二间隔序列与seq id no:18具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；第三间隔序列，该第三间隔序列与seq id no:21具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，其中所述第一间隔序列、第二间隔序列和第三间隔序列包含0-8个核苷酸修饰。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:14具有至少或约97％同源性；第二间隔序列与seq id no:18具有至少或约97％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:21具有至少或约97％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:14具有至少或约99％同源性；第二间隔序列与seq id no:18具有至少或约99％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:21具有至少或约99％同源性。在一些情况下，第一间隔序列与seq id no:14具有至少或约100％同源性；第二间隔序列与seq id no:18具有至少或约100％同源性；并且第三间隔序列与seq id no:21具有至少或约100％同源性。
90.pam序列存在于与间隔序列由于互补而结合的区域相邻的靶基因中，并鉴定与间隔核苷酸序列开始碱基配对所在的点。所需的确切pam序列因每个不同的crispr-cas系统而异，并通过已建立的生物信息学和实验程序来鉴定。pam的非限制性示例包括cca、cct、ccg、ttc、aag、agg、atg、gag和/或cc。对于i型系统，pam紧邻位于与间隔序列匹配的序列的5'，因此位于与间隔核苷酸序列碱基配对的序列的3'，并且直接被cascade识别。一旦识别前间隔序列，cascade通常会募集核酸内切酶cas3，它切割并降解靶dna。对于ii型系统，cas9/sgrna需要pam来形成r环以通过其指导rna与基因组的watson-crick配对来探询特定dna序列。pam特异性随cas9蛋白(例如，cas9的c末端的“前间隔序列相邻基序识别结构域”)的dna结合特异性而变化。
91.在一些实施方案中，待杀伤的细菌中的靶核苷酸序列是任何必需的目的靶核苷酸
序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是非必需序列。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：编码必需基因的启动子或其互补序列的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，间隔核苷酸序列与必需基因的启动子或其部分互补。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的编码或非编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。
92.在一些实施方案中，必需基因是生物体中对其生存至关重要的任何基因。然而，是否必需在很大程度上取决于生物体所处的环境。例如，只有当淀粉是唯一的能量来源时，消化淀粉所需的基因才是必需的。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶基因的启动子序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含位于靶基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。在一些实施方案中，靶核苷酸序列包含靶细菌存活所需的必需基因的至少一部分。在一些实施方案中，必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。在一些实施方案中，非必需基因是生物体中对于生存不是关键的任何基因。然而，是否非必需在很大程度上取决于生物体所处的环境。
93.在一些实施方案中，目的靶核苷酸序列的非限制性示例包括编码以下各项的靶核苷酸序列：转录调节物、翻译调节物、聚合酶基因、代谢酶、转运蛋白、rnase、蛋白酶、dna复制酶、dna修饰或降解酶、调节rna、转移rna或核糖体rna。在一些实施方案中，靶核苷酸序列是来自与细胞分裂、细胞结构、代谢、运动性、致病性、毒力或抗生素抗性相关的基因。在一些实施方案中，靶核苷酸序列来自其功能尚未表征的假设基因。因此，例如，这些基因是来自任何细菌的任何基因。
94.可通过定位代表性基因组的搜索集、使用相关参数搜索基因组并确定在crispr工程化的噬菌体中使用的间隔序列的质量来鉴定完整构建体噬菌体的适当间隔序列。
95.首先，针对目的生物体/物种/靶标来定位和获取合适的代表性基因组搜索集。该代表性基因组集可以在各种数据库中找到，包括但不限于ncbi基因库或patric数据库。ncbi基因库是可用的最大数据库之一，包含迄今为止已测序的几乎每种生物体的参考基因组和提交的基因组的混合。具体而言，对于致病性原核生物，patric(病理系统资源整合中心(pathosystems resource integration center))数据库提供了另外的综合基因组资源，并重点关注与药物产品相关的临床相关菌株和基因组。上述两个数据库都允许通过ftp(文件传输协议)服务器批量下载基因组，从而实现快速和程序化的数据集采集。
96.接下来，使用相关参数搜索基因组以定位合适的间隔序列。可以以正向和反向互补取向从起始到结束读取基因组，以定位包含pam(前间隔序列相邻基序)位点的连续dna段。间隔序列将是与pam位点的3'或5'相邻的n长度dna序列(取决于crispr系统类型)，其中n特定于目的cas系统，并且通常提前知道。可以在cas系统的发现和初步研究期间执行pam序列和间隔序列的表征。每个观察到的pam相邻间隔序列都可以保存到文件和/或数据库中以供下游使用。所需的确切pam序列因每个不同的crispr-cas系统而异，并通过已建立的生物信息学和实验程序来鉴定。
97.接下来，确定在crispr工程化的噬菌体中使用的间隔序列的质量。每个观察到的
间隔序列可以被评估以确定它们存在于多少被评估的基因组中。可以评估观察到的间隔序列以确定它们在每个给定基因组中可能出现的次数。每个基因组在多于一个位置中出现间隔序列可能是有利的，因为如果发生突变，cas系统可能无法识别靶位点，并且每个另外的“备份”位点都会增加合适的、非突变靶位置存在的可能性。可以评估观察到的间隔序列以确定它们是否出现在基因组的功能注释区域中。如果此类信息可用，则可以进一步评估功能注释以确定基因组的这些区域对于生物体的生存和功能是否“必需”。通过关注所有或几乎所有评估的目的基因组(》＝99％)中出现的间隔序列，间隔序列选择可能广泛适用于许多靶向的基因组。如果存在保守间隔序列的大选择池，则可以优先考虑出现在具有已知功能的基因组区中的间隔序列，如果这些基因组区对于生存是“必需”的并且每个基因组出现超过1次，则更优先考虑。
98.在一些实施方案中，验证了完整构建体噬菌体的间隔序列。在一些实施方案中，第一步包括鉴定在目的生物体、物种或靶标中复制的质粒。在一些实施方案中，质粒具有可选择性标记。在一些实施方案中，可选择性标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，表达盒包括用于可选择性标记的核苷酸序列。在一些实施方案中，可选择性标记是腺嘌呤脱氨酶(ada)、杀稻瘟素s脱氨酶(bsr，bsd)、博来霉素结合蛋白(ble)、新霉素磷酸转移酶(neo)、组氨醇脱氢酶(hisd)、谷氨酰胺合成酶(gs)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、胞嘧啶脱氨酶(coda)、嘌呤霉素n-乙酰转移酶(pac)或潮霉素b磷酸转移酶(hph)、氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素、多粘菌素b、红霉素、羧苄青霉素、链霉素、大观霉素、嘌呤霉素n-乙酰转移酶(pac)或吉欧霉素(sh bla)。在一些实施方案中，可选择性标记是涉及胸苷酸合酶、胸苷激酶、二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合酶的基因。在一些实施方案中，可选择性标记是编码荧光蛋白的基因。
99.在一些实施方案中，第二步包括将编码cas系统的基因插入质粒中，以便它们将在目的生物体、物种或靶标中表达。在一些实施方案中，在cas系统上游提供启动子。在一些实施方案中，启动子被目的生物体、物种或靶标识别以驱动cas系统的表达。示例性启动子包括但不限于l-阿拉伯糖诱导型(arabad，p
bad
)启动子、任何lac启动子、l-鼠李糖诱导型(rhapbad)启动子、t7 rna聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(p
l
p
l-9g-50)、脱水四环素诱导型(teta)启动子、trp、ipp、phoa、reca、prou、cst-1、cada、nar、ipp-lac、cspa、11-lac操纵基因、t3-lac操纵基因、t4基因32、t5-lac操纵基因、nprm-lac操纵基因、vhb、蛋白a、棒状杆菌-大肠杆菌样启动子、thr、horn、白喉毒素启动子、sig a、sig b、nusg、soxs、katb、α-淀粉酶(pamy)、ptms、p43(由两个重叠的rna聚合酶σ因子识别位点σa、σb构成)、ptms、p43、rplk-rpla、铁氧还蛋白启动子、和/或木糖启动子。在一些实施方案中，启动子是bba_j23102、bba_j23104或bba_j23109。在一些实施方案中，启动子源自生物体、物种或靶细菌，例如内源性crispr启动子、内源性cas操纵子启动子、p16、plpp或ptat。在一些实施方案中，启动子是噬菌体启动子，例如gp105或gp245的启动子。在一些实施方案中，在启动子和cas系统之间提供核糖体结合位点(rbs)。在一些实施方案中，rbs被目的生物体、物种或靶标识别。
100.在一些实施方案中，第三步包括将靶向基因组的间隔序列提供到质粒中。在一些实施方案中，使用生物信息学鉴定靶向基因组的间隔序列。在一些实施方案中，靶向基因组的间隔序列提供在重复序列-间隔序列-重复序列的上游。在一些实施方案中，提供了启动
子。在一些实施方案中，启动子被目的生物体、物种或靶标识别以驱动crrna的表达。在一些实施方案中，第三步的克隆包括使用不被克隆的间隔序列靶向的生物体或物种。
101.在一些实施方案中，第四步包括将非靶间隔序列提供到表达cas系统的质粒中。在一些实施方案中，非靶间隔序列包含随机序列。在一些实施方案中，非靶间隔序列包括不包含目的生物体、物种或靶标的基因组中的靶向位点的序列。在一些实施方案中，使用生物信息学确定非靶间隔序列不包含目的生物体、物种或靶标的基因组中的靶向位点。在一些实施方案中，非靶间隔序列提供在重复序列-间隔序列-重复序列的上游。在一些实施方案中，提供了启动子。在一些实施方案中，启动子被目的生物体、物种或靶标识别以驱动crrna的表达。
102.在一些实施方案中，第五步包括确定产生的每个间隔序列的功效。在一些实施方案中，确定杀伤功效。在一些实施方案中，确定每个间隔序列靶向细菌基因组的功效。在一些实施方案中，包含间隔序列的质粒与包含非靶向间隔序列的质粒相比具有约0.5倍、约1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、60倍、80倍或多达约100倍的转移率降低。重复核苷酸序列
103.在一些实施方案中，crispr阵列的重复核苷酸序列包含crispr-cas系统的任何已知重复核苷酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，重复核苷酸序列是合成序列，其包含来自crispr-cas系统的天然重复序列的二级结构(例如，内部发夹)。在一些实施方案中，重复核苷酸序列基于crispr-cas系统的已知重复核苷酸序列而彼此不同。在一些实施方案中，重复核苷酸序列各自由来自crispr-cas系统的天然重复序列的不同二级结构(例如，内部发夹)构成。在一些实施方案中，重复核苷酸序列是可与crispr-cas系统一起操作的不同重复核苷酸序列的组合。
104.在一些实施方案中，间隔序列在其5'末端连接至重复序列的3’末端。在一些实施方案中，间隔序列在其5'末端与重复序列的3'末端的约1至约8、约1至约10或约1至约15个核苷酸连接。在一些实施方案中，重复序列的约1至约8、约1至约10、约1至约15个核苷酸是重复序列的3'末端的部分。在一些实施方案中，间隔核苷酸序列在其3'末端连接到重复序列的5'末端。在一些实施方案中，间隔序列在其3'末端与重复序列的5'末端的约1至约8、约1至约10或约1至约15个核苷酸连接。在一些实施方案中，重复序列的约1至约8、约1至约10、约1至约15个核苷酸是重复序列的5'末端的部分。
105.在一些实施方案中，间隔核苷酸序列在其5'末端连接至第一重复序列，并在其3'末端连接至第二重复序列以形成重复序列-间隔序列-重复序列。在一些实施方案中，间隔序列在其5'末端连接到第一重复序列的3'末端，并且在其3'末端连接到第二重复序列的5’末端，其中间隔序列和第二重复序列进行重复以形成重复序列-(间隔序列-重复序列)n序列，其中n是从1到100的任何整数。在一些实施方案中，重复序列-(间隔序列-重复序列)n序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更多个间隔核苷酸序列。
106.在一些实施方案中，重复序列与来自野生型crispr基因座的重复序列相同或基本
相同。在一些实施方案中，重复序列是在表3中发现的重复序列。在一些实施方案中，重复序列是本文描述的序列。在一些实施方案中，重复序列包含野生型重复序列的部分(例如，野生型重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续核苷酸)。在一些实施方案中，重复序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸，或其中的任何范围)。在一些实施方案中，重复序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方案中，重复序列包含约20至40、21至40、22至40、23至40、24至40、25至40、26至40、27至40、28至40、29至40、30至30、31至40、32至40、33至40、34至40、35至40、36至40、37至40、38至40、39至40、20至39、20至38、20至37、20至36、20至35、20至34、20至33、20至32、20至31、20至30、20至29、20至28、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22或20至21个核苷酸。在一些实施方案中，重复序列包含约20至35、21至35、22至35、23至35、24至35、25至35、26至35、27至35、28至35、29至35、30至30、31至35、32至35、33至35、34至35、25至40、25至39、25至38、25至37、25至36、25至35、25至34、25至33、25至32、25至31、25至30、25至29、25至28、25至26个核苷酸。在一些实施方案中，该系统是铜绿假单胞菌i-c型cas系统。在一些实施方案中，铜绿假单胞菌i-c型cas系统具有约25至38个核苷酸的重复序列长度。
107.在一些实施方案中，重复序列与seq id no:24-28中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，重复序列与seq id no:24-28中的任一个具有至少或约95％同源性。在一些情况下，重复序列与seq id no:24-28中的任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，重复序列与seq id no:24-28中的任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，重复序列与seq id no:24-28中的任一个具有100％同源性。在一些情况下，重复序列包含具有seq id no:24-28中任一个的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个或多于32个核苷酸的至少一部分。转录激活剂
108.在一些实施方案中，核酸序列进一步包含转录激活剂。在一些实施方案中，编码的转录激活剂调节靶细菌内目的基因的表达。在一些实施方案中，转录激活剂激活靶细菌内目的基因的表达，无论是外源的还是内源的。在一些实施方案中，转录激活剂通过破坏靶细菌内的一种或多种抑制元件的活性来激活靶细菌内的目的表达基因。在一些实施方案中，抑制元件包括转录阻遏物。在一些实施方案中，抑制元件包含全局转录阻遏物。在一些实施方案中，抑制元件是组蛋白样类核结构(h-ns)蛋白或其同源物或功能片段。在一些实施方案中，抑制元件是亮氨酸应答性调控蛋白(lrp)。在一些实施方案中，抑制元件是cody蛋白。
109.在某些细菌中，crispr-cas系统在大多数环境条件下表达差并被认为是沉默的。在这些细菌中，crispr-cas系统的调节是转录调节物(例如，广泛参与宿主基因组的转录调节的组蛋白样类核结构(h-ns)蛋白)活性的结果。h-ns通过沿富含at的位点进行多聚化而导致dna弯曲，从而控制宿主的转录调节。在一些细菌中，例如大肠杆菌，crispr-cas3操纵
子的调节受h-ns调节。
110.相似地，在一些细菌中，crispr-cas系统的阻遏是由抑制元件控制的，例如亮氨酸应答性调控蛋白(lrp)。lrp已涉及与转录起始位点的上游和下游区域结合。值得注意的是，lrp在调节crispr-cas系统的表达中的活性因细菌而异。与具有广泛的种间阻遏活性的h-ns不同，lrp已显示出差异调节宿主crispr-cas系统的表达。因此，在一些情况下，lrp反映了不同细菌中调节crispr-cas系统表达的宿主特异性的手段。
111.在一些情况下，crispr-cas系统的阻遏也受抑制元件cody的控制。cody是一种gtp感应转录阻遏物，其通过dna结合而起作用。细胞内gtp浓度充当环境营养状况的指标。在正常培养条件下，gtp丰富并且与cody结合以阻遏转录活性。但是，随着gtp浓度的降低，cody与dna结合的活性变得较低，从而允许以前被阻遏的基因发生转录。因此，cody充当严格的全局转录阻遏物。
112.在一些实施方案中，转录激活剂是leuo多肽、其任何同源物或功能片段、leuo编码序列或上调leuo的试剂。在一些实施方案中，转录激活剂包含leuo的任何直系同源物或功能等价物。在一些细菌中，与h-ns相反，leuo作为全局转录调节物，对细菌的环境营养状况作出应答而发挥作用。在正常情况下，leuo表达不佳。然而，在氨基酸饥饿和/或细菌生命周期中达到稳定期的情况下，leuo被上调。leuo的表达增加导致它在重叠的启动子区拮抗h-ns以影响基因表达。leuo的过度表达上调了crispr-cas系统的表达。在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)中，leuo驱动casabcde操纵子的表达增加，该操纵子具有预测的在casa上游的leuo和h-ns结合序列。
113.在一些实施方案中，leuo的表达导致抑制元件的破坏。在一些实施方案中，由于leuo的表达而导致的抑制元件的破坏消除了crispr-cas系统的转录阻遏。在一些实施方案中，leuo的表达消除了由于h-ns的活性而导致的crispr-cas系统的转录阻遏。在一些实施方案中，由于leuo的表达而导致的抑制元件的破坏导致crispr-cas系统的表达增加。在一些实施方案中，由于由leuo的表达引起的抑制元件的破坏而导致的crispr-cas系统表达的增加导致包含crispr阵列的核酸序列的crispr-cas加工增加。在一些实施方案中，由于由leuo的表达引起的抑制元件的破坏而导致的crispr-cas系统表达的增加导致包含crispr阵列的核酸序列的crispr-cas加工增加，从而提高crispr阵列对细菌的杀伤致死率水平。在一些实施方案中，转录激活剂导致噬菌体和/或crispr-cas系统的活性增加。调节元件
114.在一些实施方案中，核酸序列与各种启动子、终止子和其他调节元件可操作地关联，用于在各种生物体或细胞中表达。在一些实施方案中，核酸序列还包含前导序列。在一些实施方案中，核酸序列进一步包含启动子序列。在一些实施方案中，至少一个启动子和/或终止子可操作地连接crispr阵列。使用对本公开有用的任何启动子，包括例如对目的生物体起作用的启动子以及组成型、诱导型、发育调节型、组织特异性/偏好性启动子等，如本文公开的。如本文所用的调节元件是内源的或异源的。在一些实施方案中，将源自对象生物体的内源性调节元件插入其非天然存在的遗传环境中(例如，在基因组中与自然界中发现的不同的位置)，从而产生重组核酸或非天然核酸。
115.在一些实施方案中，核酸序列的表达是组成型的、诱导型的、时间调节型的、发育调节型的或化学调节型的。在一些实施方案中，通过将核酸序列与在目的生物体中起作用
的启动子可操作地连接，使核酸序列的表达成为组成型的、诱导型的、时间调节型的、发育调节型的或化学调节型的。在一些实施方案中，通过将核酸序列与在目的生物体中起作用的诱导型启动子可操作地连接来使阻遏可逆。本文公开的启动子的选择根据表达的数量、时间和空间要求以及要转化的宿主细胞而变化。
116.用于本文公开的方法、噬菌体和组合物的示例性启动子包括在细菌中起作用的启动子。例如l-阿拉伯糖诱导型(arabad，p
bad
)启动子、任何lac启动子、l-鼠李糖诱导型(rhapbad)启动子、t7 rna聚合酶启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体启动子(p
l
p
l-9g-50)、脱水四环素诱导型(teta)启动子、trp、ipp、phoa、reca、prou、cst-1、cada、nar、ipp-lac、cspa、11-lac操纵基因、t3-lac操纵基因、t4基因32、t5-lac操纵基因、nprm-lac操纵基因、vhb、蛋白a、棒状杆菌-大肠杆菌样启动子、thr、horn、白喉毒素启动子、sig a、sig b、nusg、soxs、katb、α-淀粉酶(pamy)、ptms、p43(由两个重叠的rna聚合酶σ因子识别位点σa、σb构成)、ptms、p43、rplk-rpla、铁氧还蛋白启动子、和/或木糖启动子。在一些实施方案中，启动子是bba_j23102启动子。在一些实施方案中，启动子在广泛范围的细菌中起作用，例如bba_j23104、bba_j23109。在一些实施方案中，启动子源自靶细菌，例如内源性crispr启动子、内源性cas操纵子启动子、p16、plpp或ptat。在一些实施方案中，启动子是噬菌体启动子，例如gp105或gp245的启动子。
117.在一些实施方案中，启动子与seq id no:1-11中的任一个具有至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些情况下，启动子与seq id no:1-11中的任一个具有至少或约95％同源性。在一些情况下，启动子与seq id no:1-11中的任一个具有至少或约97％同源性。在一些情况下，启动子与seq id no:1-11中的任一个具有至少或约99％同源性。在一些情况下，启动子与seq id no:1-11中的任一个具有100％同源性。在一些情况下，启动子包含具有seq id no:1-11中任一个的至少或约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或多于50个核苷酸的至少一部分。在一些情况下，启动子包含具有seq id no:1-11中任一个的至少或约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215个或多于215个核苷酸的至少一部分。
118.在一些实施方案中，使用诱导型启动子。在一些实施方案中，化学调节型启动子用于通过应用外源性化学调节剂来调节在生物体中基因的表达。使用化学调节型启动子使得rna和/或由核酸序列编码的多肽仅在例如用诱导化学品处理生物体时才能合成。在使用化学诱导型启动子的一些实施方案中，化学品的应用诱导基因表达。在其中使用化学阻遏型启动子的一些实施方案中，化学品的应用阻遏基因表达。在一些实施方案中，启动子是光诱导型启动子，其中特定波长的光的应用诱导基因表达。在一些实施方案中，启动子是光阻遏型启动子，其中特定波长的光的应用阻遏基因表达。表达盒
119.在一些实施方案中，核酸序列是表达盒或在表达盒中。在一些实施方案中，表达盒被设计为表达本文公开的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列是编码crispr-cas系统的组分的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码i型crispr-cas系统的组分的表达
盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码可操作的crispr-cas系统的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码i型crispr-cas系统的可操作组分(包括cascade和cas3)的表达盒。在一些实施方案中，核酸序列是编码i型crispr-cas系统的可操作组分(包括crrna、cascade和cas3)的表达盒。
120.在一些实施方案中，包含目的核酸序列的表达盒是嵌合的，这意味着它的组分中的至少一种相对于它的其它组分中的至少一种是异源的。在一些实施方案中，表达盒是天然存在的，但已经以可用于异源表达的重组形式获得。
121.在一些实施方案中，表达盒包括在所选宿主细胞中起作用的转录和/或翻译终止区(即终止区)。在一些实施方案中，终止区负责终止超出目的异源核酸序列的转录并负责正确的mrna多聚腺苷酸化。在一些实施方案中，终止区对于转录起始区是天然的，对于可操作地连接的目的核酸序列是天然的，对于宿主细胞是天然的或者来源于另一个来源(即相对于启动子、目的核酸序列、宿主或其任何组合是外源或异源的)。在一些实施方案中，终止子可操作地连接至本文公开的核酸序列。
122.在一些实施方案中，表达盒包括用于可选择性标记的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码可选择性标记或可筛选性标记，取决于标记是否赋予通过化学方式选择的特征，例如通过使用选择性试剂(例如抗生素)，或取决于标记是否仅仅是通过观察或测试(例如通过筛选(例如荧光))识别的特征。载体
123.除了表达盒之外，本文公开的核酸序列(例如，包含crispr阵列的核酸序列)与载体一起使用。载体包括核酸分子，其包含待转移、递送或引入的(一个或多个)核苷酸序列。一般类型的载体的非限制性示例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体或农杆菌双元载体，其呈双链或单链线性或环状形式，可以是或可以不是可自传递的或可移动的。载体通过整合到细胞基因组中或在染色体外存在(例如具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。另外，包括穿梭载体，其意指能够自然地或通过设计在两种不同宿主生物体中复制的dna载体。在一些实施方案中，穿梭载体在放线菌和细菌和/或真核生物中复制。在一些实施方案中，载体中的核酸在宿主细胞中在用于转录的合适启动子或其他调节元件的控制下并且与其可操作地连接。在一些实施方案中，载体是在多个宿主中起作用的双功能性表达载体。密码子优化
124.在一些实施方案中，核酸序列被密码子优化以在任何目的物种中表达。密码子优化涉及使用物种特异性密码子使用表来修饰核苷酸序列的密码子使用偏倚。密码子使用表是基于对目的物种的最高表达基因的序列分析生成的。当核苷酸序列要在细胞核中表达时，密码子使用表是基于对目的物种的高表达核基因的序列分析生成的。通过将物种特异性密码子使用表与天然多核苷酸序列中存在的密码子进行比较来确定核苷酸序列的修饰。核苷酸序列的密码子优化导致核苷酸序列与天然核苷酸序列具有小于100％(例如50％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)同一性，但仍编码具有与由原始核苷酸序列编码的相同功能的多肽。在一些实施方案中，本公开的核酸序列被密码子优化以在目的生物体/物种中表达。
转化
125.在一些实施方案中，本文公开的核酸序列和/或表达盒被瞬时表达和/或稳定地掺入宿主生物的基因组中。在一些实施方案中，通过本领域技术人员已知的任何方法将本文公开的核酸序列和/或表达盒引入细胞中。转化的示例性方法包括通过感受态细胞的电穿孔转化、感受态细胞的被动摄取、感受态细胞的化学转化，以及导致将核酸引入细胞的任何其他电气、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。在一些实施方案中，细胞的转化包括核转化。在一些实施方案中，细胞的转化包括质粒转化和接合。
126.在一些实施方案中，当引入多于一个核酸序列时，核苷酸序列被组装为单个核酸构建体的部分或作为单独的核酸构建体，并且位于相同或不同的核酸构建体上。在一些实施方案中，核苷酸序列在单个转化事件中或在分开的转化事件中被引入目的细胞中。i型crispr-cas系统
127.在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-a型系统、i-b型系统、i-c型系统、i-d型系统、i-e型系统或i-f型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-a型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-b型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-c型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-d型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-e型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统是i-f型系统。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统包含cascade多肽。i型cascade多肽加工crispr阵列以产生加工后的rna，所述加工后的rna然后用于将复合物结合到与加工后的rna中的间隔序列互补的靶序列。在一些实施方案中，i型cascade复合物是i-a型cascade多肽、i-b型cascade多肽、i-c型cascade多肽、i-d型cascade多肽、i-e型cascade多肽、i-f型cascade多肽或i-u型cascade多肽。
128.在一些实施方案中，i型cascade复合物包含：(a)编码cas7(csa2)多肽的核苷酸序列、编码cas8a1(csx13)多肽或cas8a2(csx9)多肽的核苷酸序列、编码cas5多肽的核苷酸序列、编码csa5多肽的核苷酸序列、编码cas6a多肽的核苷酸序列、编码cas3'多肽的核苷酸序列和编码没有核酸酶活性的cas3”多肽的核苷酸序列(i-a型)；(b)编码cas6b多肽的核苷酸序列、编码cas8b(csh1)多肽的核苷酸序列、编码cas7(csh2)多肽的核苷酸序列和编码cas5多肽的核苷酸序列(i-b型)；(c)编码cas5d多肽的核苷酸序列、编码cas8c(csd1)多肽的核苷酸序列和编码cas7(csd2)多肽的核苷酸序列(i-c型)；(d)编码casl od(csc3)多肽的核苷酸序列、编码csc2多肽的核苷酸序列、编码csc1多肽的核苷酸序列和编码cas6d多肽的核苷酸序列(i-d型)；(e)编码cse1(casa)多肽的核苷酸序列、编码cse2(casb)多肽的核苷酸序列、编码cas7(casc)多肽的核苷酸序列、编码cas5(casd)多肽的核苷酸序列和核苷酸编码cas6e(case)多肽的核苷酸序列(i-e型)；和/或(f)编码cys1多肽的核苷酸序列、编码cys2多肽的核苷酸序列、编码cas7(cys3)多肽的核苷酸序列和编码cas6f多肽的核苷酸序列(i-f型)。
129.在一些实施方案中，i型crispr-cas系统对于靶细菌是外源的。靶细菌
130.在一些实施方案中，靶细菌包括靶细菌的一个或多个物种。在一些实施方案中，靶细菌包括靶细菌的一种或多种菌株。在一些实施方案中，靶细菌的非限制性示例包括埃希氏菌属物种(escherichia spp.)、沙门氏菌属物种(salmonella spp.)、芽孢杆菌属物种
(bacillus spp.)、棒状杆菌属物种(corynebacterium spp.)、梭菌属物种(clostridium spp.)、梭状菌属物种(clostridioides spp.)、假单胞菌属物种(pseudomonas spp.)、乳球菌属物种(lactococcus spp.)、不动杆菌属物种(acinetobacter spp.)、分枝杆菌属物种(mycobacterium spp.)、粘球菌属物种(myxococcus spp.)、葡萄球菌属物种(staphylococcus spp.)、链球菌属物种(streptococcus spp.)、肠球菌属物种(enterococcus spp.)、拟杆菌属物种(bacteroides spp.)、梭杆菌属物种(fusobacterium spp.)、放线菌属物种(actinomyces spp.)、卟啉单胞菌属物种(porphyromonas spp.)或蓝细菌(cyanobacteria)。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括大肠杆菌(escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(salmonella enterica)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、丙酮丁醇梭菌(clostridium acetobutylicum)、永达尔梭菌(clostridium ljungdahlii)、艰难梭菌(clostridioides difficile)、鲍氏梭菌、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、结核分枝杆菌、脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessus)、细胞内分枝杆菌(mycobacterium intracellulare)、偶然分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)、龟分枝杆菌(mycobacterium chelonae)、鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)、戈登分枝杆菌(mycobacterium gordonae)、黄色粘球菌(myxococcus xanthus)、酿脓链球菌或蓝细菌。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、耐碳青霉烯肠杆菌科、产超广谱β-内酰胺酶(esbl)的肠杆菌科、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、微细棒状杆菌(corynebacterium minutissimum)、假白喉棒状杆菌(corynebacterium pseudodiphtheriticum)、纹带棒状杆菌(corynebacterium striatum)、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、缓症链球菌、血链球菌(streptococcus sanguinis)、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉菌属(moraxella sp.)、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、以色列放线菌(actinomyces israelii)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)、产黑色素普雷沃氏菌、幽门螺杆菌、猫螺杆菌、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、屎肠球菌(enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(enterococcus gallinarum)、脆弱拟杆菌(bacteroides fragilis)、多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、活泼瘤胃球菌(ruminococcus gnavus)或空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)。细菌的其他非限制性示例包括乳酸菌，包括但不限于乳酸杆菌属物种(lactobacillus spp.)和双歧杆菌属物种(bifidobacterium spp.)；电燃料细菌菌株，包括但不限于土杆菌属物种(geobacter spp.)、梭菌属物种或富养罗尔斯通氏菌(ralstonia eutropha)；或对例如植物和哺乳动物具有致病性的细菌。在一些实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌。在一些实施方案中，细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，细菌是艰难梭菌。在一些实施方案中，细菌是金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，细菌是肺炎克雷伯菌。在一些实施方案中，细菌是粪肠球菌。在一些实施方案中，细菌是屎肠球菌。在一些实施方案中，细菌是脆弱拟杆菌。在一些实施方案中，细菌是多形拟杆菌。在一些实施方案中，细菌是具核梭杆菌。在一些实施方案中，细菌是鹑鸡肠球菌。在一些实施方案中，细菌是活泼瘤胃球菌。在一些实施方案中，细菌是鲍曼不动杆菌。在一些实施方案中，细菌是结核分枝杆菌。在一些实施方案中，细菌是肺炎链球菌。在一些实施方案中，细菌是流感嗜血杆菌。在一些实施方案中，细菌是淋病奈瑟氏菌。
131.在一些实施方案中，靶细菌引起感染或疾病。在一些实施方案中，感染或疾病是急性的或慢性的。在一些实施方案中，感染或疾病是局部的或全身的。在一些实施方案中，感染或疾病是特发性的。在一些实施方案中，感染或疾病通过以下方式获得，所述方式包括但不限于呼吸吸入、摄食、皮肤和伤口感染、血流感染、中耳感染、胃肠道感染、腹膜感染、尿路感染、泌尿生殖道感染、口腔软组织感染、腹内感染、表皮或粘膜吸收、眼部感染(包括隐形眼镜污染)、心内膜炎、囊性纤维化感染、留置式医疗器械(如关节假体)的感染、种植牙、导管和心脏植入物、性接触、和/或医院获得性和呼吸机相关的细菌性肺炎。在一些实施方案中，靶细菌引起尿路感染。在一些实施方案中，大肠杆菌引起尿路感染。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧炎性疾病。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧自身免疫性疾病。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧炎性肠病(ibd)。在一些实施方案中，大肠杆菌引起炎性肠病(ibd)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧银屑病。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧银屑病关节炎(pa)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧类风湿性关节炎(ra)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧系统性红斑狼疮(sle)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧多发性硬化症(ms)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧格雷夫斯病。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧桥本甲状腺炎。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧重症肌无力。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧血管炎。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧癌症。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧癌症进展。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧癌症转移。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧对癌症疗法的抗性。在一些实施方案中，用于治疗癌症的疗法包括但不限于化学疗法、免疫疗法、激素疗法、靶向药物疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，癌症在器官中发展，包括但不限于肛门、膀胱、血液和血液成分、骨、骨髓、脑、乳房、子宫颈、结肠和直肠、食道、肾、喉、淋巴系统、肌肉(即软组织)、口腔和咽部、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤、小肠、胃、睾丸、甲状腺、子宫和/或外阴。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧中枢神经系统(cns)的障碍。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧注意力缺陷/多动障碍(adhd)。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧自闭症。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧双相情感障碍。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧重度抑郁症。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧癫痫。在一些实施方案中，靶细菌引起和/或加剧神经退行性疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、亨廷顿病和/或帕金森病。
132.囊性纤维化和囊性纤维化相关支气管扩张与铜绿假单胞菌感染有关。参见，例如，p.farrell等人，radiology,第252卷,第2期,第534-543页(2009)。在一些实施方案中，将一种或多种噬菌体施用于患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者。在一些实施方案中，将两种或更多种噬菌体的组合施用于患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者。在一些实施方案中，将噬菌体施用于患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者导致患者中细菌负荷的减少。在一些实施方案中，细菌负荷的减少导致患有囊性纤维化或囊性纤维化相关支气管扩张的患者的临床改善。
133.非囊性纤维化支气管扩张与铜绿假单胞菌感染有关。参见，例如，r.wilson等人,respiratory medicine,第117卷,第179-189页(2016)。在一些实施方案中，将一种或多种噬菌体施用于患有非囊性纤维化支气管扩张的患者。在一些实施方案中，将两种或更多种噬菌体的组合施用于患有非囊性纤维化支气管扩张的患者。在一些实施方案中，将噬菌体
施用于患有非囊性纤维化支气管扩张的患者导致患者中细菌负荷的减少。在一些实施方案中，细菌负荷的减少导致患有非囊性纤维化支气管扩张的患者的临床改善。噬菌体
134.在一些实施方案中，噬菌体是专性裂解性噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是具有保留的溶原性基因的温和噬菌体。在一些实施方案中，噬菌体是温和噬菌体，其中一些溶原性基因被去除、替换或灭活。在一些实施方案中，噬菌体是温和噬菌体，其中溶原性基因被去除、替换或灭活，从而使噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体包括但不限于p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p1772、pb1、p004k或p004ex。在一些实施方案中，噬菌体是靶向假单胞菌属物种的p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363或pb1。在一些实施方案中，噬菌体是靶向埃希氏菌属物种的p004k或p00ex。在一些实施方案中，噬菌体靶向假单胞菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向铜绿假单胞菌。在一些实施方案中，噬菌体包括但不限于p004k或p00ex。在一些实施方案中，噬菌体靶向埃希氏菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向大肠杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向葡萄球菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向克雷伯菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向肺炎克雷伯菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向肠球菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向屎肠球菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向粪肠球菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向鹑鸡肠球菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向梭菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向艰难梭菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向拟杆菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向脆弱拟杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向多形拟杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向梭杆菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向具核梭杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向链球菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向肺炎链球菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向不动杆菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向鲍曼不动杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向分枝杆菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向结核分枝杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向嗜血杆菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向流感嗜血杆菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向奈瑟氏菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向淋病奈瑟氏菌。在一些实施方案中，噬菌体靶向瘤胃球菌属物种。在一些实施方案中，噬菌体靶向活泼瘤胃球菌。
135.在一些实施方案中，目的噬菌体获自环境来源或商业研究供应商。在一些实施方案中，针对细菌及其相关菌株文库的裂解活性筛选获得的噬菌体。在一些实施方案中，针对细菌及其相关菌株文库在筛选的细菌中产生初级抗性的能力来筛选噬菌体。插入位点
136.在一些实施方案中，核酸序列插入噬菌体中保留了噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，核酸序列插入到噬菌体基因组中。在一些实施方案中，核酸序列插入噬菌体基因组中在目的操纵子末端在转录终止子位点处。在一些实施方案中，核酸序列插入噬菌体基因组中作为一种或多种去除的非必需基因的替代物。在一些实施方案中，核酸序列插入噬菌体基因组中作为一种或多种去除的溶原性基因的替代物。在一些实施方案中，用核酸序列替代非必需和/或溶原性基因不影响噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替代非必需和/或溶原性基因保留了噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替
代非必需和/或溶原性基因增强了噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，用核酸序列替代非必需和/或溶原性基因使溶原性噬菌体获得裂解性。
137.在一些实施方案中，核酸序列被引入噬菌体基因组的第一位置，而一个或多个非必需和/或溶原性基因从噬菌体基因组中的不同位置被单独去除和/或失活。在一些实施方案中，核酸序列在被引入噬菌体的第一位置，而一个或多个非必需和/或溶原性基因从噬菌体基因组中的多个不同位置被单独去除和/或失活。在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的去除和/或失活不影响噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的去除和/或失活保留了噬菌体的裂解活性。在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的去除使溶原性噬菌体变成裂解性噬菌体。
138.在一些实施方案中，噬菌体是温和噬菌体，已通过任何上述方式使其获得裂解性。在一些实施方案中，通过一种或多种溶原性基因的去除、替换或失活而使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性是由于至少一种溶原性基因的去除、替换或失活。在一些实施方案中，溶原性基因在维持噬菌体中的溶原周期中起作用。在一些实施方案中，溶原性基因在噬菌体中建立溶原周期中起作用。在一些实施方案中，溶原性基因在噬菌体中的溶原周期的建立和溶原周期的维持中都起作用。在一些实施方案中，溶原性基因是阻遏基因。在一些实施方案中，溶原性基因是ci阻遏基因。在一些实施方案中，溶原性基因是激活基因。在一些实施方案中，溶原性基因是cii基因。在一些实施方案中，溶原性基因是lexa基因。在一些实施方案中，溶原性基因是int(整合酶)基因。在一些实施方案中，去除、替换或灭活两个或更多个溶原性基因以引起噬菌体溶原周期的停滞和/或裂解周期的诱导。在一些实施方案中，通过插入一种或多种裂解性基因使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过插入一种或多种有助于诱导裂解周期的基因使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，通过改变一种或多种有助于诱导裂解周期的基因的表达来使温和噬菌体获得裂解性。在一些实施方案中，温和噬菌体在表型上从溶原性噬菌体变为裂解性噬菌体。在一些实施方案中，温和噬菌体因环境改变获得裂解性。在一些实施方案中，环境改变包括但不限于温度、ph或营养物的改变，暴露于抗生素、过氧化氢、外源性dna或dna损伤剂，有机碳的存在和重金属(例如，以铬(vi)的形式的重金属)的存在。在一些实施方案中，防止获得裂解性的温和噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，通过第一引入的crispr阵列的自我靶向活性来防止获得裂解性的温和噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，通过引入另外的crispr阵列来防止获得裂解性的温和噬菌体回复到溶原状态。在一些实施方案中，除了由噬菌体的裂解活性和/或第一或第二crispr阵列的活性引起的细胞死亡之外，噬菌体不赋予靶细菌任何新的特性。
139.在一些实施方案中，一种或多种非必需和/或溶原性基因的替换、去除、失活或其任何组合通过化学、生物化学和/或任何合适的方法实现。在一些实施方案中，一种或多种裂解性基因的插入通过任何合适的化学、生物化学和/或物理方法通过同源重组来实现。非必需基因
140.在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是对于噬菌体的存活而言非必需的基因。在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是对于诱导和/或维持裂解周期非必需的基因。在一些实施方案中，要从噬菌体去除和/或替换的非必需基因是来自t4大肠杆菌噬菌体的hoc基因。在一些实施方案中，要去除和/或替换的
非必需基因包括来自t7大肠杆菌噬菌体gp0.7、gp4.3、gp4.5、gp4.7或其任何组合。在一些实施方案中，要去除和/或替换的非必需基因是来自t7m大肠杆菌噬菌体gp0.6、gp0.65、gp0.7、gp4.3、gp4.5或其任何组合。抗微生物剂和肽
141.在一些实施方案中，本文公开的噬菌体被进一步遗传修饰以表达抗细菌肽、抗细菌肽的功能片段或裂解性基因。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体表达至少一种本文公开的抗微生物剂或肽。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体包含编码酶的核酸序列，其中所述核酸序列的蛋白质产物靶向噬菌体抗性细菌。在一些实施方案中，噬菌体包含编码有助于分解或降解生物膜基质的酶的核酸。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体包含核酸，所述核酸编码分散蛋白d氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或裂解酶。在一些实施方案中，酶选自纤维素酶，例如纤维素酶的糖基羟化酶家族，例如也称为纤维素酶a的酶的糖基羟化酶5家族；聚葡糖胺(pga)解聚酶；和结肠酸(colonic acid)解聚酶，例如1,4-l-岩藻糖苷水解酶、荚膜异多糖酸、解聚褐藻酸酶、dnase i或其组合。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体分泌本文公开的酶。
142.在一些实施方案中，抗微生物剂或肽由本文公开的噬菌体表达和/或分泌。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体分泌和表达抗生素，例如氨苄青霉素、青霉素、青霉素衍生物、头孢菌素、单环内酰胺、碳青霉烯、氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciproflaxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)或本文公开的任何抗生素。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体包含编码抗细菌肽的核酸序列、表达抗细菌肽或分泌有助于或增强杀伤靶细菌的肽。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体包含编码肽的核酸序列、编码抗细菌肽的核酸序列，表达抗细菌肽或分泌有助于或增强第一和/或第二i型crispr-cas系统的活性的肽。使用方法
143.在某些实施方案中，本文公开了杀伤靶细菌的方法，所述方法包括将本文公开的任何噬菌体引入靶细菌中。
144.在某些实施方案中，本文进一步公开了对具有包含必需基因中的靶核苷酸序列的第一细菌物种和不包含必需基因中的靶核苷酸序列的第二细菌物种的细菌细胞混合群体进行修饰的方法，所述方法包括将本文公开的任何噬菌体引入所述细菌细胞混合群体。
145.在某些实施方案中，本文还公开了在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用本文公开的任何噬菌体。
146.在一些实施方案中，仅通过噬菌体的裂解活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，仅通过crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过crispr-cas系统加工crispr阵列以产生经加工的crrna来杀伤靶细菌，所述经加工的crrna能够指导基于crispr-cas的核酸内切酶活性和/或在细菌的靶基因中的靶核苷酸序列处的切割。
147.在一些实施方案中，通过噬菌体的裂解活性与i型crispr-cas系统的活性相组合杀伤靶细菌。在一些实施方案中，通过独立于噬菌体的裂解活性的crispr-cas系统的活性杀伤靶细菌。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统的活性补充或增强噬菌体的裂解活性。
148.在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性和i型crispr-cas系统的活性是协同的。在一些实施方案中，噬菌体的裂解活性受噬菌体浓度的调节。在一些实施方案中，i型crispr-cas系统的活性受噬菌体浓度的调节。
149.在一些实施方案中，通过增加施用于细菌的噬菌体的浓度，调节细菌的协同杀伤以有利于噬菌体的裂解活性超过第一crispr-cas系统的活性的杀伤。在一些实施方案中，通过降低施用于细菌的噬菌体的浓度，调节细菌的协同杀伤以不利于噬菌体的裂解活性超过crispr-cas系统的活性的杀伤。在一些实施方案中，在低浓度下，裂解性复制允许扩增和靶细菌的杀伤。在一些实施方案中，在高浓度下，不需要扩增噬菌体。在一些实施方案中，通过改变间隔序列的数量、长度、组成、同一性或其任何组合以增加crispr阵列的杀伤力，调节细菌的协同杀伤以有利于crispr-cas系统的活性超过噬菌体的裂解活性的杀伤。在一些实施方案中，通过改变间隔序列的数量、长度、组成、同一性或其任何组合以降低crispr阵列的杀伤力，调节细菌的协同杀伤以不利于crispr-cas系统的活性超过噬菌体的裂解活性的杀伤。施用途径和剂量
150.本文公开的组合物的施用剂量和持续时间将取决于多种因素，包括对象的年龄、对象的体重和噬菌体的耐受性。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体通过动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮下、吸入或其任何组合施用于患者。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体通过口服施用给予患者。
151.在一些实施方案中，给予103和10
20
pfu之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予103和10
10
pfu之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予106和10
20
pfu之间的噬菌体剂量。在一些实施方案中，给予106和10
10
pfu之间的噬菌体剂量。例如，在一些实施方案中，噬菌体以103和10
11
pfu之间的量存在于组合物中。在一些实施方案中，噬菌体以约103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
16
、10
17
、10
18
、10
19
、10
20
、10
21
、10
22
、10
23
、10
24
pfu或更多的量存在于组合物中。在一些实施方案中，噬菌体以小于101pfu的量存在于组合物中。在一些实施方案中，噬菌体以101至108、104至109、105至10
10
或107至10
11
pfu的量存在于组合物中。
152.在一些实施方案中，将噬菌体或混合物施用给有此需要的对象一天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24次。在一些实施方案中，将噬菌体或混合物施用给有此需要的对象一周至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21次。在一些实施方案中，将噬菌体或混合物施用给有此需要的对象一月至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90次一个月。在一些实施方案中，每2、4、6、8、10、12、14、18、20、22或24小时向有此需要的对象施用噬菌体或混合物。
153.在一些实施方案中，本文公开的组合物(噬菌体)在疾病或病症发生之前、期间或之后施用。在一些实施方案中，施用含有噬菌体的组合物的时间是不同的。在一些实施方案中，药物组合物用作预防剂并连续施用给具有病症或疾病倾向的对象以预防疾病或病症的发生。在一些实施方案中，在症状发作期间或之后尽快将药物组合物施用于对象。在一些实施方案中，组合物的施用在症状发作的前48小时内、症状发作的前24小时内、症状发作的前6小时内或症状发作的3小时内开始。在一些实施方案中，组合物的初始施用是通过任何可行的途径，例如通过使用本文描述的任何制剂的本文描述的任何途径。在一些实施方案中，在检测到或怀疑疾病或病症发作后，可在切实可行的情况下尽快施用组合物，并持续治疗该疾病所需的时间长度，例如约1个月至约3个月。在一些实施方案中，治疗的长度将因每个对象而异。细菌感染
154.在某些实施方案中，本文公开了治疗细菌感染的方法。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体治疗或预防人类或动物对象中由本文公开的细菌介导或引起的疾病或病症。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体治疗或预防人类或动物对象中由本文公开的细菌引起或恶化的疾病或病症。此类细菌通常与对象的组织接触，包括：肠、口腔、肺、腋窝、眼、阴道、肛门、耳、鼻或咽喉组织。在一些实施方案中，通过调节细菌的活性和/或通过直接杀伤细菌来治疗细菌感染。
155.在一些实施方案中，靶细菌的非限制性示例包括埃希氏菌属物种(escherichia spp.)、沙门氏菌属物种(salmonella spp.)、芽孢杆菌属物种(bacillus spp.)、棒状杆菌属(corynebacterium)、梭菌属物种(clostridium spp.)、梭菌属物种(clostridium spp.)、假单胞菌属物种(pseudomonas spp.)、梭菌属物种(clostridium spp.)、乳球菌属物种(lactococcus spp.)、不动杆菌属物种(acinetobacter spp.)、分枝杆菌属物种(mycobacterium spp.)、粘球菌属物种(myxococcus spp.)、葡萄球菌属物种(staphylococcus spp.)、链球菌属物种(streptococcus spp.)或蓝细菌。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌、永达尔梭菌、艰难梭菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌、黄色粘球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或蓝细菌。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、耐碳青霉烯肠杆菌科、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、微细棒状杆菌(corynebacterium minutissium)、假白喉棒状杆菌(corynebacterium pseudodiphtheriae)、纹带棒状杆菌(corynebacterium stratium)、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肺炎链球菌、缓症链球菌、血链球菌(streptococcus sanguis)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉菌属、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、放线菌属物种(actinomyces spp.)、卟啉单胞菌属物种(porphyromonas spp.)、产黑色素普雷沃氏菌、幽门螺杆菌、猫螺杆菌或空肠弯曲杆菌。细菌的其他非限制性示例包括乳酸菌，包括但不限于乳酸杆菌属物种和双歧杆菌属物种；电燃料细菌菌株，包括但不限于土杆菌属物种、梭菌属物种或富养罗尔斯通氏菌；或对例如植物和哺乳动物具有致病性的细菌。在一些实施方案中，细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，细菌是艰难梭菌。在一些实施方案中，细菌是铜绿假单胞菌。
156.在一些实施方案中，存在于细菌群中的一种或多种靶细菌是致病的。在一些实施
方案中，病原细菌是尿道致病性的。在一些实施方案中，病原细菌是尿道致病性大肠杆菌(upec)。在一些实施方案中，病原细菌是致腹泻性的。在一些实施方案中，病原细菌是致腹泻性大肠杆菌(dec)。在一些实施方案中，病原细菌产生志贺毒素。在一些实施方案中，病原细菌是产生志贺毒素大肠杆菌(stec)。在一些实施方案中，病原细菌产生志贺毒素。在一些实施方案中，病原细菌是产生志贺毒素大肠杆菌(stec)。在一些实施方案中，病原细菌是产生志贺毒素大肠杆菌(stec)。在一些实施方案中，病原细菌是各种o-抗原:h-抗原血清型大肠杆菌。在一些实施方案中，病原细菌是致肠病性的。在一些实施方案中，病原细菌是致肠病性大肠杆菌(epec)。
157.在一些实施方案中，病原菌是艰难梭菌的各种菌株，包括：cd043、cd05、cd073、cd093、cd180、cd106、cd128、cd199、cd111、cd108、cd25、cd148、cd154、fobt195、cd03、cd038、cd112、cd196、cd105、uk1、uk6、bi-9、cd041、cd042、cd046/cd19或r20291。
158.在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于治疗对象胃肠道中的感染、疾病或病症。在一些实施方案中，噬菌体用于调节和/或杀伤对象的微生物组或肠道菌群内的靶细菌。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌中的一种或多种靶细菌。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌中的一种或多种靶肠道病原细菌。在一些实施方案中，靶致肠病性细菌是致肠病性大肠杆菌(epec)。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌中的一种或多种靶致腹泻性细菌。在一些实施方案中，靶致腹泻性细菌是致腹泻性大肠杆菌(dec)。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的微生物组或肠道菌群内的多种细菌中的一种或多种产生志贺毒素的靶细菌。在一些实施方案中，产生志贺毒素的细菌是产生志贺毒素的大肠杆菌(stec)。
159.在一些实施方案中，噬菌体用于选择性调节和/或杀伤对象的微生物组或肠道菌群内的一种或多种靶致肠病性艰难梭菌细菌菌株，包括：cd043、cd05、cd073、cd093、cd180、cd106、cd128、cd199、cd111、cd108、cd25、cd148、cd154、fobt195、cd03、cd038、cd112、cd196、cd105、uk1、uk6、bi-9、cd041、cd042、cd046、cd19或r20291。
160.在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于治疗对象泌尿道中的感染、疾病或病症。在一些实施方案中，噬菌体用于调节和/或杀伤对象的泌尿道菌群内的靶细菌。泌尿道菌群包括但不限于表皮葡萄球菌、粪肠球菌、和一些α-溶血性链球菌(alpha-hemolytic streptococci)。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的泌尿道菌群内的多种细菌中的一种或多种靶致尿道病性细菌。在一些实施方案中，靶细菌是尿道致病性大肠杆菌(upec)。
161.在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于治疗对象皮肤上的感染、疾病或病症。在一些实施方案中，噬菌体用于调节和/或杀伤对象皮肤上的靶细菌。
162.在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于治疗对象的粘膜上的感染、疾病或病症。在一些实施方案中，噬菌体用于调节和/或杀伤对象的粘膜上的靶细菌。
163.在一些实施方案中，病原细菌具有抗生素抗性。在一个实施方案中，病原菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)。
164.在一些实施方案中，存在于细菌群中的一种或多种靶细菌形成生物膜。在一些实
施方案中，生物膜包含病原细菌。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于处理生物膜。
165.在一些实施方案中，靶细菌的非限制性示例包括埃希氏菌属物种(escherichia spp.)、沙门氏菌属物种(salmonella spp.)、芽孢杆菌属物种(bacillus spp.)、棒状杆菌属梭菌属物种(corynebacterium clostridium spp.)、梭菌属物种(clostridium spp.)、假单胞菌属物种(pseudomonas spp.)、梭菌属物种(clostridium spp.)、乳球菌属物种(lactococcus spp.)、不动杆菌属物种(acinetobacter spp.)、分枝杆菌属物种(mycobacterium spp.)、粘球菌属物种(myxococcus spp.)、葡萄球菌属物种(staphylococcus spp.)、链球菌属物种(streptococcus spp.)或蓝细菌。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、丙酮丁醇梭菌、永达尔梭菌、艰难梭菌、鲍曼不动杆菌、结核分枝杆菌、黄色粘球菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌或蓝细菌。在一些实施方案中，细菌的非限制性示例包括金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、耐碳青霉烯肠杆菌科、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、微细棒状杆菌(corynebacterium minutissium)、假白喉棒状杆菌(corynebacterium pseudodiphtheriae)、纹带棒状杆菌(corynebacterium stratium)、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肺炎链球菌、缓症链球菌、血链球菌(streptococcus sanguis)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、粘质沙雷氏菌、流感嗜血杆菌、莫拉菌属、脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、放线菌属物种(actinomyces spp.)、卟啉单胞菌属物种(porphyromonas spp.)、产黑色素普雷沃氏菌、幽门螺杆菌、猫螺杆菌或空肠弯曲杆菌。细菌的其他非限制性示例包括乳酸菌，包括但不限于乳酸杆菌属物种和双歧杆菌属物种；电燃料细菌菌株，包括但不限于土杆菌属物种、梭菌属物种或富养罗尔斯通氏菌；或对例如植物和哺乳动物具有致病性的细菌。在一些实施方案中，细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，细菌是艰难梭菌。
166.在一些实施方案中，噬菌体治疗痤疮和其他相关的皮肤感染。
167.在一些实施方案中，靶细菌是多重耐药(mdr)细菌菌株。mdr菌株是对至少一种抗生素具有抗性的细菌菌株。在一些实施方案中，细菌菌株对抗生素例如头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素和甲氧西林具有抗性。在一些实施方案中，细菌菌株对抗生素具有抗性，所述抗生素例如头孢托罗(ceftobiprole)、头孢洛林(ceftaroline)、克林霉素(clindamycin)、达巴万星(dalbavancin)、达托霉素(daptomycin)、利奈唑胺(linezolid)、莫匹罗星(mupirocin)、奥利万星(oritavancin)、泰地唑胺(tedizolid)、特拉万星(telavancin)、替加环素(tigecycline)、万古霉素(vancomycin)、氨基糖苷、碳青霉烯(carbapenem)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢吡肟(cefepime)、头孢托罗(ceftobiprole)、氟喹诺酮(fluoroquinolone)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、利奈唑胺(linezolid)、链霉杀阳菌素(streptogramin)、替加环素(tigecycline)、达托霉素(daptomycin)或其任意组合。mdr菌株的示例包括：耐万古霉素肠球菌(vre)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)、产超广谱β-内酰胺酶(esbl)的革兰氏阴性细菌、产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(kpc)的革兰氏阴性细菌和多重耐药性革兰氏阴性杆菌(mdr gnr)mdrgn细菌，例如肠杆菌属物种大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌或铜绿假单胞菌。
168.在一些实施方案中，靶细菌是肺炎克雷伯菌。在一些实施方案中，靶细菌是金黄色
葡萄球菌。在一些实施方案中，靶细菌是肠球菌属。在一些实施方案中，靶细菌是不动杆菌属。在一些实施方案中，靶细菌是假单胞菌属。在一些实施方案中，靶细菌是肠杆菌属。在一些实施方案中，靶细菌是艰难梭菌。在一些实施方案中，靶细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，靶细菌是鲍氏梭菌。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物用于兽医和医学应用以及研究应用。微生物组
[0169]“微生物组”、“微生物群”和“微生物生境”在下文中可互换使用，指的是生活在对象的体表、腔体和体液之上或之中的微生物的生态群落。微生物组生境的非限制性示例包括：肠道、结肠、皮肤、皮肤表面、皮肤毛孔、阴道腔、脐区、结膜区域、肠道区域、胃、鼻腔和通道、胃肠道、泌尿生殖道、唾液、粘液和粪便。在一些实施方案中，微生物组包含微生物材料，包括但不限于细菌、古生菌、原生生物、真菌和病毒。在一些实施方案中，微生物材料包含革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，微生物材料包含革兰氏阳性细菌。在一些实施方案中，微生物材料包含变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)或厚壁菌门(firmicutes)。
[0170]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于调节或杀伤对象的微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，噬菌体用于通过crispr-cas系统、裂解活性或其组合来调节和/或杀伤微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，噬菌体用于调节和/或杀伤对象的微生物组内的靶细菌。在一些实施方案中，噬菌体用于选择性地调节和/或杀伤来自对象的微生物组内的多种细菌中的一种或多种靶细菌。在一些实施方案中，靶细菌是大肠杆菌。在一些实施方案中，大肠杆菌是多重耐药性(mdr)菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是超广谱β-内酰胺酶(esbl)菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是耐碳青霉烯菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是非多重耐药性(非mdr)菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌是非耐碳青霉烯菌株。在一些实施方案中，病原细菌是尿道致病性的。在一些实施方案中，病原细菌是尿道致病性大肠杆菌(upec)。在一些实施方案中，病原细菌是致腹泻性的。在一些实施方案中，病原细菌是致腹泻性大肠杆菌(dec)。在一些实施方案中，病原细菌产生志贺毒素。在一些实施方案中，病原细菌是产生志贺毒素大肠杆菌(stec)。在一些实施方案中，病原细菌是各种o-抗原:h-抗原血清型大肠杆菌。在一些实施方案中，病原细菌是致肠病性的。在一些实施方案中，病原细菌是致肠病性大肠杆菌(epec)。
[0171]
在一些实施方案中，噬菌体用于调节或杀伤对象的胃肠道的微生物组或肠道菌群内的单一或多种靶细菌。微生物组或肠道菌群的改变(例如生态失调)会增加健康状况的风险，例如糖尿病、精神障碍、溃疡性结肠炎、结直肠癌、自身免疫性疾病、肥胖症、糖尿病、中枢神经系统疾病和炎性肠病。与胃肠道疾病和病症相关并且被噬菌体调节或杀伤的示例性细菌包括大肠杆菌的菌株、亚菌株和肠道型。
[0172]
在一些实施方案中，噬菌体用于选择性调节和/或杀伤对象的微生物组内的一种或多种靶致肠病性艰难梭菌细菌菌株，包括：cd043、cd05、cd073、cd093、cd180、cd106、cd128、cd199、cd111、cd108、cd25、cd148、cd154、fobt195、cd03、cd038、cd112、cd196、cd105、uk1、uk6、bi-9、cd041、cd042、cd046、cd19或r20291。
[0173]
在一些实施方案中，噬菌体用于调节或杀伤对象的胃肠道的微生物组或肠道菌群内的单一或多种靶细菌。微生物组或肠道菌群的改变(例如生态失调)会增加健康状况的风
险，例如糖尿病、精神障碍、溃疡性结肠炎、结直肠癌、自身免疫性疾病、肥胖症、糖尿病、中枢神经系统疾病和炎性肠病。与胃肠道疾病和病症相关并且被噬菌体调节或杀伤的细菌的示例性列表包括以下的菌株、亚菌株和肠道型：肠杆菌科(enterobacteriaceae)、巴氏杆菌科(pasteurellaceae)、梭杆菌科(fusobacteriaceae)、奈瑟氏菌科(neisseriaceae)、韦荣氏球菌科(veillonellaceae)、孪生菌科(gemellaceae)、拟杆菌目(bacteriodales)、梭菌目(clostridiales)、丹毒丝菌科(erysipelotrichaceae)、双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)、拟杆菌属(bacteroides)、粪杆菌属(faecalibacterium)、罗斯氏菌属(roseburia)、布劳特氏菌属(blautia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、粪球菌属(coprococcus)、链球菌属(streptococcus)多尔氏菌属(dorea)、布劳特氏菌属(blautia)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、乳杆菌属(lactobacillus)、肠球菌属(enterococcus)、链球菌属(streptococcus)大肠杆菌(escherichia coli)、具核梭杆菌、副流感嗜血杆菌(haemophilus parainfluenzae)(巴氏杆菌科(pasteurellaceae))、小韦荣氏球菌(veillonella parvula)、侵蚀艾肯菌(eikenella corrodens)(奈瑟氏菌科(neisseriaceae))、gemella moribillum、普通拟杆菌(bacteroides vulgatus)、粪便拟杆菌(bacteroides caccae)、两岐双岐杆菌(bifidobacterium bifidum)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)、齿双歧杆菌(bifidobacterium dentum)、blautia hansenii、活泼瘤胃球菌、系结梭菌(clostridium nexile)、普氏粪杆菌(faecalibacterium prausnitzii)、ruminoccus torques、鲍氏梭菌、直肠真杆菌(eubacterium rectale)、肠罗氏菌(roseburia intestinalis)、陪伴粪球菌(coprococcus comes)、放线菌属(actinomyces)、乳球菌属(lactococcus)、罗斯氏菌属(roseburia)、链球菌属(streptococcus)布劳特氏菌属(blautia)、戴阿利斯特菌属(dialister)、脱硫弧菌属(desulfovibrio)、埃希氏杆菌属(escherichia)、乳杆菌属(lactobacillus)、粪球菌属(coprococcus)、梭菌属(clostridium)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、颗粒链菌属(granulicatella)、真杆菌属(eubacterium)、厌氧棒状菌属(anaerostipes)、副拟杆菌属(parabacteroides)、粪芽孢菌属(coprobacillus)、戈氏杆菌属(gordonibacter)、柯林斯氏菌属(collinsella)、拟杆菌属(bacteroides)、粪杆菌属(faecalibacterium)、厌氧棍状菌属(anaerotruncus)、另枝杆菌属(alistipes)、嗜血杆菌属(haemophilus)、厌氧球菌属(anaerococcus)、韦荣氏球菌属(veillonella)、arevotella、阿克曼菌属(akkermansia)、嗜胆菌属(bilophila)、萨特菌属(sutterella)、伊格尔兹氏菌属(eggerthella)、霍尔德曼氏菌属(holdemania)、孪生球菌属(gemella)、嗜胨菌属(peptoniphilus)、罗氏菌属(rothia)、肠球菌属(enterococcus)、片球菌属(pediococcus)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、臭气杆菌属(odoribacter)、肠细菌(enterobacteria)、梭杆菌属(fusobacterium)、和变形杆菌属(proteus)。
[0174]
在一些实施方案中，将本文公开的噬菌体施用于对象以促进健康的微生物组。在一些实施方案中，将本文公开的噬菌体施用于对象，以将对象的微生物组恢复为促进健康的微生物组组合物。在一些实施方案中，包含本文公开的噬菌体的组合物包含益生元或第三试剂。在一些实施方案中，通过本文公开的噬菌体治疗与微生物组有关的疾病或病况。环境疗法
[0175]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体还用于食品和农业卫生(包括肉类、水果和蔬菜卫生)、医院卫生、家庭卫生、交通工具和设备卫生、工业卫生等。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于从医学、兽医、畜牧业或细菌传递给人或动物的任何其他环境中去除耐药性或其他不良病原体。
[0176]
噬菌体在卫生保健机构中的环境应用是用于设备(例如内窥镜)和环境(例如icu)，这些设备和环境由于难以或不可能消毒的病原体而成为医院内感染的潜在来源。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于治疗被对常用消毒剂具有抗性的细菌属(例如假单胞菌属)占据的设备或环境。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体组合物用于消毒无生命的物体。在一些实施方案中，本文公开的环境用具有噬菌体滴度的水溶液喷雾、涂覆或倾倒在其上。在一些实施方案中，本文所述的溶液包含10
1-10
20
个噬斑形成单位(pfu)/ml。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体通过包括干分散剂的雾化剂施加，以促进噬菌体向环境中分布。在一些实施方案中，将物体浸入含有本文公开的噬菌体的溶液中。卫生
[0177]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体在多种领域中用作卫生剂。尽管可以使用术语“噬菌体(phage)”或“噬菌体(bacteriophage)”，但应注意，在适当的情况下，该术语应广义地解释为包括单个噬菌体、多个噬菌体，例如噬菌体混合物和噬菌体与试剂如消毒剂、洗涤剂、表面活性剂、水等的混合物。
[0178]
在一些实施方案中，噬菌体用于消毒医院设施，包括手术室、患者室、候诊室、实验室或其他各种医院设备。在一些实施方案中，该设备包括心电图仪、呼吸器、心血管辅助设备、主动脉内球囊泵、输液设备、其他患者护理设备、电视、监视器、遥控器、电话、床等。在一些情况下，噬菌体通过气溶胶罐施加。在一些实施方案中，噬菌体通过用转移媒介擦拭物体上的噬菌体来施加。
[0179]
在一些实施方案中，本文所述的噬菌体与患者护理装置结合使用。在一些实施方案中，噬菌体与常规的呼吸机或呼吸治疗装置结合使用以清洁患者之间的内表面和外表面。呼吸机的实例包括在手术期间支持通气的设备、支持无行为能力的患者的通气的设备以及类似设备。在一些实施方案中，传统疗法包括自动或电动设备，或手动袋式设备，例如急诊室和救护车中常见的设备。在一些实施方案中，呼吸疗法包括吸入器以引入药物(例如通常与慢性阻塞性肺疾病或哮喘一起使用的支气管扩张药)，或维持气道通畅的装置，例如连续的气道正压装置。
[0180]
在一些实施方案中，本文所述的噬菌体用于清洁表面并治疗存在高传染性细菌性疾病如脑膜炎或肠感染的区域中的定殖的人。
[0181]
在一些实施方案中，用本文公开的组合物处理供水。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于处理污水、在水箱、井、储水池、储水箱、渡槽、导管和类似的水分配装置中发现的水。在一些实施方案中，噬菌体被应用于工业储罐，在该工业储罐中水、油、冷却流体和其他液体积聚在收集池中。在一些实施方案中，将本文公开的噬菌体周期性地引入工业储罐以减少细菌生长。
[0182]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于清洁生活区，例如房屋、公寓、公寓大厦、宿舍或任何生活区域。在一些实施方案中，噬菌体用于对公共区域进行消毒，所述公共区域例如剧院、音乐厅、博物馆、火车站、机场、宠物区域例如宠物床或垃圾箱。以这种能力，
将噬菌体由常规设备分配(包括泵喷雾器、气雾剂容器、注射瓶、预湿的药巾等)直接应用于(例如喷洒到)要消毒的区域，或通过转移媒介(例如毛巾、海绵等)转移到该区域。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体被应用于房屋的各种房间，包括厨房、卧室、浴室、车库、地下室等。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体的方式与常规清洁剂相同。在一些实施方案中，噬菌体与常规清洁剂结合(之前、之后或同时)施用，条件是配制常规清洁剂以保持足够的噬菌体生物学活性。
[0183]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体在纸产品的加工期间或完成加工之后被添加到纸产品的组分中。添加了本文公开的噬菌体的纸产品包括但不限于纸巾、卫生纸、湿纸巾。食品安全
[0184]
在一些实施方案中，本文所述的噬菌体用于任何食品或营养补充剂中，以防止污染。所述食品或营养补充剂的示例是奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于奶的粉末、婴儿配方食品或片剂、液体悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管喂养物。
[0185]
噬菌体消毒的广义概念适用于其他农业应用和生物。包括水果和蔬菜、乳制品农产品和其他农产品。例如，刚切好的产品经常在被病原细菌污染的情况下到达加工厂。这导致了可追溯到农产品的食源性疾病的爆发。在一些实施方案中，通过对与食源性疾病相关的细菌物种具有特异性的单一噬菌体或噬菌体混合物的应用，将噬菌体制剂应用于农产品显著降低或消除了食源性疾病的可能性。在一些实施方案中，在生产和加工的各个阶段应用噬菌体以减少该点的细菌污染或防止随后点的污染。
[0186]
在一些实施方案中，特定的噬菌体被应用于餐馆、杂货店、农产品配送中心的农产品。在一些实施方案中，本文公开的噬菌体定期或连续地应用于沙拉吧的水果和蔬菜内容物。在一些实施方案中，将噬菌体应用于沙拉吧或对食品的外部进行消毒是喷雾或喷洒过程或洗涤过程。
[0187]
在一些实施方案中，本文所述的噬菌体用于基质或支持介质中，其具有包含肉类、农产品、切碎的水果和蔬菜以及其他食品的包装。在一些实施方案中，适用于包装的聚合物用噬菌体制剂浸渍。
[0188]
在一些实施方案中，本文所述的噬菌体用于农舍和牲畜饲料。在一些实施方案中，在饲养牲畜的农场中，向牲畜提供在其饮用水、食物或饮用水与食物两者中的噬菌体。在一些实施方案中，将本文所述的噬菌体喷洒到屠体上并用于对屠宰区进行消毒。
[0189]
在农产品上使用特定的噬菌体作为生物防治剂提供了许多优点。例如，噬菌体是天然、无毒的产品，不会像普通化学消毒剂那样扰乱天然微生物区系的生态平衡，但会特异性溶解靶向的食源性病原体。因为噬菌体与化学消毒剂不同，它是与宿主细菌一起进化的天然产物，对最近出现的抗性细菌有活性的新噬菌体在需要时会被迅速鉴定，而鉴定一种新的有效消毒剂是一个更长的过程，需要数年时间。药物组合物
[0190]
在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含(a)本文公开的核酸序列；和(b)药学上可接受的赋形剂。此外，在某些实施方案中，本文公开的是药物组合物，其包含
(a)如本文公开的噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，本文进一步公开的是药物组合物，其包含(a)本文公开的组合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
[0191]
在一些实施方案中，本公开提供了药物组合物和施用该组合物以治疗细菌、古细菌感染或对区域进行消毒的方法。在一些实施方案中，药物组合物包含在药学上可接受的载剂(carrier)中的任何上述试剂。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗泌尿道感染(uti)和/或炎性疾病(例如炎性肠病(ibd))。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗克罗恩病。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物或方法治疗溃疡性结肠炎。
[0192]
在一些实施方案中，本文公开的组合物包含药用剂、药物剂、载剂、佐剂、分散剂、稀释剂等。
[0193]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体被配制用于根据合适的方法在药物载剂中施用。在一些实施方案中，在根据本公开的药物组合物的制备过程中，将噬菌体与尤其是可接受的载剂混合。在一些实施方案中，载剂是固体(包括粉末)或液体，或固体与液体两者，并且优选配制成单位剂量组合物。在一些实施方案中，将一种或多种噬菌体掺入本文公开的通过任何合适的药房方法制备的组合物中。
[0194]
在一些实施方案中，描述了在体内治疗对象的方法，所述方法包括向对象施用药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的载剂中的本文公开的噬菌体，其中所述药物组合物以治疗有效量施用。在一些实施方案中，通过本领域已知的任何方式将噬菌体施用于有需要的人类对象或动物。
[0195]
在一些实施方案中，本文公开的噬菌体用于口服施用。在一些实施方案中，噬菌体以固体剂型例如胶囊、片剂和粉末剂施用，或以液体剂型例如酏剂、糖浆和悬浮剂施用。在一些实施方案中，适合于颊(舌下)施用的组合物和方法包括在风味基质中包含噬菌体的锭剂，所述风味基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；以及在惰性基质中包含噬菌体的锭剂，所述惰性基质例如为明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶。
[0196]
在一些实施方案中，本公开内容的方法和组合物适合于肠胃外施用，其包含噬菌体的无菌水性溶液和非水性注射溶液。在一些实施方案中，这些制剂与预期受体的血液等渗。在一些实施方案中，这些制剂包含抗氧化剂、缓冲剂、硫双二氯酚和溶质，其使组合物与预期受体的血液等渗。在一些实施方案中，水性和非水性无菌悬浮液包括悬浮剂和增稠剂。在一些实施方案中，本文公开的组合物存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且存储在立即使用前仅需要添加无菌液体载体(例如，盐水或注射用水)的冻干条件下。
[0197]
在一些实施方案中，适于直肠施用的方法和组合物作为单位剂量栓剂存在。在一些实施方案中，通过将噬菌体与一种或多种常规固体载体(例如可可脂)混合，然后使所得混合物成形来制备这些组合物。在一些实施方案中，适合于局部施用于皮肤的方法和组合物为软膏、乳剂、洗剂、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油的形式。在一些实施方案中，所使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮增强剂及其两种或更多种的组合。
[0198]
在一些实施方案中，适于经皮施用的方法和组合物以适于与受体的表皮保持长时间的紧密接触的离散贴剂的形式存在。
[0199]
在一些实施方案中，适用于经鼻施用或以其他方式施用给对象的肺的方法和组合
物包括任何合适的方式，例如，通过由对象吸入的包含噬菌体组合物的可吸入颗粒的气雾悬浮液来施用。在一些实施方案中，可吸入颗粒是液体或固体。如本文所用，“气雾剂”包括任何气体悬浮相，其能够被吸入细支气管或鼻道中。在一些实施方案中，液体颗粒的气雾剂通过任何合适的装置产生，例如用压力驱动的气雾剂雾化器或超声雾化器。在一些实施方案中，通过药物领域中已知的技术，用任何固体颗粒药物气雾剂产生器产生包含所述组合物的固体颗粒的气雾剂。
[0200]
在一些实施方案中，适于将本文公开的噬菌体施用至物体表面或对象的方法和组合物包括水溶液。在一些实施方案中，将这样的水溶液喷雾到物体的表面或对象上。在一些实施方案中，水溶液用于冲洗和清洁对象的包含细菌的外来异物形式的物理伤口。
[0201]
在一些实施方案中，以治疗有效量向对象施用本文公开的噬菌体。在一些实施方案中，将本文公开的至少一种噬菌体组合物配制为药物制剂。在一些实施方案中，所述药物制剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种本文公开的噬菌体。在一些情况下，药物制剂包含本文所述的噬菌体和以下中的至少一种：赋形剂、稀释剂或载体。
[0202]
在一些实施方案中，药物制剂包含赋形剂。赋形剂在美国药学会的《药用赋形剂手册》(1986)中进行了描述，包括但不限于溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂和润滑剂。
[0203]
合适的赋形剂的非限制性实例包括但不限于缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
[0204]
在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括但不限于柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，药物制剂包含列出的任何一种或多种缓冲剂：碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐。
[0205]
在一些实施方案中，赋形剂是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性示例包括但不限于抗氧化剂，例如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(bht)、丁基化羟基苯甲醚(bha)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、蛋氨酸、乙醇和n-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，防腐剂包括井冈霉素a、tl-3、原钒酸钠、氟化钠、n-a-甲苯磺酰基-phe-氯甲基酮、n-a-甲苯磺酰基-lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸盐、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷基化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
[0206]
在一些实施方案中，药物制剂包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基氧杂唑、聚乙烯醇、c
12-c
18
脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其组合。
[0207]
在一些实施方案中，在药物制剂中使用的粘合剂选自淀粉，例如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糊精；天然和合成树胶；明胶；纤
维素衍生物，例如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(peg)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，例如山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇和水或其组合。
[0208]
在一些实施方案中，药物制剂包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、氢化植物油(sterotex)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，药物制剂中的润滑剂选自金属硬脂酸盐(例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(例如硬脂富马酸钠)、脂肪酸(例如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(peg)、十二烷基金属硫酸盐(例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石粉或它们的混合物
[0209]
在一些实施方案中，赋形剂包含调味剂。在一些实施方案中，调味剂包括天然油；植物、树叶、花和水果的提取物；及其组合。
[0210]
在一些实施方案中，赋形剂包含甜味剂。合适的甜味剂的非限制性示例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载剂时)；糖精及其各种盐类，例如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物，甘草甜素；甜叶菊(甜菊糖)；蔗糖的氯代衍生物，例如三氯蔗糖；以及糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。
[0211]
在一些情况下，药物制剂包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食品、药物和化妆品颜色(fd&c)、药物和化妆品颜色(d&c)以及外部药物和化妆品颜色(ext.d&c)。
[0212]
在一些实施方案中，本文公开的药物制剂包含螯合剂。在一些实施方案中，螯合剂包括乙二胺-n,n,n’,n
’‑
四乙酸(edta)；edta的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；edta的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物。
[0213]
在一些情况下，药物制剂包含稀释剂。稀释剂的非限制性实例包括水、甘油、甲醇、乙醇和其他类似的生物相容性稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂是含水酸，例如乙酸、柠檬酸、马来酸、盐酸、磷酸、硝酸、硫酸或类似酸。
[0214]
在一些实施方案中，药物制剂包含表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂选自但不限于聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨酸酯)、月桂基硫酸钠、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯烷基醚、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇(peg)、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、多库酯钠、季铵化合物、氨基酸(例如l-亮氨酸)、脂肪酸的糖酯、脂肪酸的甘油酯或其组合。
[0215]
在一些情况下，药物制剂包含另外的药剂。在一些实施方案中，另外的药剂是抗生素剂。在一些实施方案中，抗生素剂是由氨基糖苷、安沙霉素、碳头孢烯、碳青霉烯、头孢菌素(包括第一、第二、第三、第四和第五代头孢菌素)、林可酰胺、大环内酯、单菌胺、硝基呋喃、喹诺酮、青霉素、磺胺、多肽或四环素组成的集合。
[0216]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是氨基糖苷，例如阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素或巴龙霉素。在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是安沙霉素，例如格尔德霉素或除莠霉素。
[0217]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是碳头孢烯，例如氯碳头孢。在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是碳青霉烯，例如厄他培南、多立培南、亚胺培南/西司他丁或美罗培南。
[0218]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是头孢菌素(第一代)，例如头孢羟氨苄、
头孢唑林、头孢氨苄、头孢噻吩，或可替代地是头孢菌素(第二代)例如头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯或头孢呋辛。在一些实施方案中，抗生素剂是头孢菌素(第三代)，例如头孢克肟、头孢地尼、头孢托伦、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢布烯、头孢唑肟和头孢曲松，或是头孢菌素(第四代)，例如头孢吡肟或头孢比普。
[0219]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是林可酰胺，例如克林霉素和阿奇霉素，或大环内酯，例如阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、泰利霉素和壮观霉素。
[0220]
在一些实施方案中，本文描述的抗生素是单菌胺类，例如氨曲南，或是硝基呋喃，例如呋喃唑酮或呋喃妥因。
[0221]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是青霉素，例如阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素g或v、哌拉西林、替莫西林和替卡西林。
[0222]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是磺酰胺，例如磺胺米隆、2,4-二氨基偶氮苯-4-磺酰胺、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺嘧啶银、磺胺甲二唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、柳氮磺吡啶、磺胺异恶唑、三甲氧苄氨嘧啶或三甲氧苄氨嘧啶-硫胺甲基异唑(复方增效磺胺)(tmp-smx)。
[0223]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是喹诺酮，例如环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星和替马沙星。
[0224]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是多肽，例如杆菌肽，粘菌素或多粘菌素b。
[0225]
在一些实施方案中，本文所述的抗生素剂是四环素，例如地美环素、多西环素、米诺环素或土霉素。编号的实施方案
[0226]
编号的实施方案1包含噬菌体，其包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。编号的实施方案2包括实施方案1的噬菌体，其中所述crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。编号的实施方案3包括实施方案2的噬菌体，其中所述至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至所述间隔序列。编号的实施方案4包括实施方案1-3中任一项的噬菌体，其中所述间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。编号的实施方案5包括实施方案1-4的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。编号的实施方案6包括实施方案1-5的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。编号的实施方案7包括实施方案1-6的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。编号的实施方案8包括实施方案1-7的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。编号的实施方案9包括实施方案1-8的噬菌体，其中所述必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。编号的实施方案10包括实施方案1-9中任一项的噬菌体，其中所述cascade多肽形成i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型
crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的cascade复合物。编号的实施方案11包括实施方案1-10中任一项的噬菌体，其中所述cascade复合物包含：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型crispr-cas系统)。编号的实施方案12包括实施方案1-11的噬菌体，其中所述cas复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。编号的实施方案13包括实施方案1-12中任一项的噬菌体，其中所述核酸序列进一步包含启动子序列。编号的实施方案14包括实施方案1-13中任一项的噬菌体，其中仅通过所述噬菌体的裂解活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案15包括实施方案1-14中任一项的噬菌体，其中仅通过所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案16包括实施方案1-15中任一项的噬菌体，其中通过所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性相组合杀伤所述靶细菌。编号的实施方案17包括实施方案1-16中任一项的噬菌体，其中通过独立于所述噬菌体的裂解活性的所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案18包括实施方案1-17中任一项的噬菌体，其中所述crispr-cas系统的活性补充或增强所述噬菌体的裂解活性。编号的实施方案19包括实施方案1-18中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体的裂解活性和所述crispr-cas系统的活性是协同的。编号的实施方案20包括实施方案1-19中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体的裂解活性、所述crispr-cas系统的活性或所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性两者均受所述噬菌体的浓度调节。编号的实施方案21包括实施方案1-20中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体感染多种细菌菌株。编号的实施方案22包括实施方案1-21中任一项的噬菌体，其中所述靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何任何组合。编号的实施方案23包括实施方案1-22中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。编号的实施方案24包括实施方案1-23中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。编号的实施方案25包括实施方案1-24的噬菌体，其中通过溶原性基因的去除、替换或失活而使所述温和噬菌体获得裂解性。编号的实施方案26包括实施方案1-25中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p004k或pb1。编号的实施方案27包括实施方案1-26中任一项的噬菌体，其中所述核酸序列插入非必需噬菌体基因中。编号的实施方案28包括一种药物组合物，其包含：(a)实施方案1-27中任一项的噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。编号的实施方案29包括实施
方案1-28的药物组合物，其中所述药物组合物呈片剂、液体剂、糖浆剂、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼用制剂、耳用制剂、皮下制剂、可吸入性呼吸制剂、栓剂及其任何组合的形式。编号的实施方案30包括一种杀伤靶细菌的方法，所述方法包括将包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体引入靶细菌中，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。编号的实施方案31包括实施方案1-30的方法，其中所述crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。编号的实施方案32包括实施方案1-31的方法，其中所述至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至所述间隔序列。编号的实施方案33包括实施方案1-32中任一项的方法，其中所述间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。编号的实施方案34包括实施方案1-33的方法，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。编号的实施方案35包括实施方案1-34的方法，其中所述靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。编号的实施方案36包括实施方案1-35的方法，其中所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。编号的实施方案37包括实施方案1-36的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。编号的实施方案38包括实施方案1-37的方法，其中所述必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。编号的实施例39包含实施例1-38中任一项的方法，其中所述cascade多肽形成i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的cascade复合物。编号的实施方案40包括实施方案1-39中任一项的方法，其中所述cascade复合物包含：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型crispr-cas系统)。编号的实施方案41包括实施方案1-40的方法，其中所述cascade复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。编号的实施方案42包括实施方案1-41中任一项的方法，其中所述核酸序列进一步包含启动子序列。编号的实施方案43包括实施方案1-42中任一项的方法，其中仅通过所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案44包括实施方案1-43中任一项的方法，其中通过所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性相组合杀伤所述靶细菌。编号的实施方案45包括实施方案1-43中任一项的方法，其中通过独立于所述噬菌体的裂解活性的所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案46包括实施方案1-45中任一项的方法，其中所述crispr-cas系统的活性补充或增强所述噬菌体的裂解活性。编号的实施方案47包括实施方案1-46中任一项的方法，其中所述噬菌体的裂解活性和所述crispr-cas系统的活性是协同的。编号的实施方案48包括实施方案1-47中任一项的方法，其中所述噬菌体的裂解活性、所述crispr-cas系统的活性或所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性两者均受所述噬菌体的浓度调节。编号的实施方案49包括实施方案1-48中任一项的方法，其中所述噬菌体感染多种细菌菌株。编号的实施方案50包括实施方案1-49中任
一项的方法，其中所述靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。编号的实施方案51包括实施方案1-50中任一项的方法，其中所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。编号的实施方案52包括实施方案1-51中任一项的方法，其中所述噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。编号的实施方案53包括实施方案1-52的方法，其中通过溶原性基因的去除、替换或失活而使所述温和噬菌体获得裂解性。编号的实施方案54包括实施方案1-53中任一项的方法，其中所述噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。编号的实施方案55包括实施方案1-54中任一项的方法，其中所述核酸序列插入在非必需噬菌体基因处或与非必需噬菌体基因相邻。编号的实施方案56包括实施方案1-55中任一项的方法，其中细菌细胞的混合群体包含所述靶细菌。编号的实施方案57包括一种在有需要的个体中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)cascade多肽；和(c)cas3多肽。编号的实施方案58包括实施方案1-57的方法，其中所述crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。编号的实施方案59包括实施方案1-58的方法，其中所述至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至所述间隔序列。编号的实施方案60包括实施方案1-59中任一项的方法，其中所述间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。编号的实施方案61包括实施方案1-60的方法，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。编号的实施方案62包括实施方案1-61的方法，其中所述靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。编号的实施方案63包括实施方案1-62的方法，其中所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。编号的实施方案64包括实施方案1-63的方法，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。编号的实施方案65包括实施方案1-64的方法，其中所述必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。编号的实施方案66包括实施方案1-65中任一项的方法，其中所述cascade复合物包含i-a型crispr-cas系统、i-b型crispr-cas系统、i-c型crispr-cas系统、i-d型crispr-cas系统、i-e型crispr-cas系统或i-f型crispr-cas系统的cascade多肽。编号的实施方案67包括实施方案1-66中任一项的方法，其中所述cascade复合物包含：(i)cas7多肽、cas8a1多肽或cas8a2多肽、cas5多肽、csa5多肽、cas6a多肽、cas3'多肽和不具有核酸酶活性的cas3”多肽(i-a型crispr-cas系统)；(ii)cas6b多肽、cas8b多肽、cas7多肽和cas5多肽(i-b型crispr-cas系统)；(iii)cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)；(iv)cas10d多肽、csc2多肽、csc1多肽、cas6d多肽(i-d型crispr-cas系统)；(v)cse1多肽、cse2多肽、cas7多肽、cas5多肽和cas6e多肽(i-e型crispr-cas系统)；(vi)csy1多肽、csy2多肽、csy3多肽和csy4多肽(i-f型
crispr-cas系统)。编号的实施方案68包括实施方案1-67的方法，其中所述cascade复合物包含cas5d多肽、cas8c多肽和cas7多肽(i-c型crispr-cas系统)。编号的实施方案69包括实施方案1-68中任一项的方法，其中所述核酸序列进一步包含启动子序列。编号的实施方案70包括实施方案1-69中任一项的方法，其中仅通过所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案71包括实施方案1-70中任一项的方法，其中通过所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性相组合杀伤所述靶细菌。编号的实施方案72包括实施方案1-71中任一项的方法，其中通过独立于所述噬菌体的裂解活性的所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案73包括实施方案1-72中任一项的方法，其中所述crispr-cas系统的活性补充或增强所述噬菌体的裂解活性。编号的实施方案74包括实施方案1-73中任一项的方法，其中所述噬菌体的裂解活性和所述crispr-cas系统的活性是协同的。编号的实施方案75包括实施方案1-74中任一项的方法，其中所述噬菌体的裂解活性、所述crispr-cas系统的活性或所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性两者均受所述噬菌体的浓度调节。编号的实施方案76包括实施方案1-75中任一项的方法，其中所述噬菌体感染多种细菌菌株。编号的实施方案77包括实施方案1-76中任一项的方法，其中所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。编号的实施方案78包括实施方案1-77中任一项的方法，其中所述噬菌体是获得裂解性的温和噬菌体。编号的实施方案79包括实施方案1-78的方法，其中通过溶原性基因的去除、替换或失活而使所述温和噬菌体获得裂解性。编号的实施方案80包括实施方案1-79中任一项的方法，其中所述噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。编号的实施方案81包括实施方案1-80中任一项的方法，其中所述核酸序列插入在非必需噬菌体基因处或与非必需噬菌体基因相邻。编号的实施方案82包括实施方案1-81中任一项的方法，其中所述疾病是细菌感染。编号的实施方案83包括实施方案1-82中任一项的方法，其中引起所述疾病的靶细菌是对至少一种抗生素具有抗性的耐药细菌。编号的实施方案84包括实施方案1-83的方法，其中所述耐药细菌对至少一种抗生素具有抗性。编号的实施方案85包括实施方案1-84中任一项的方法，其中引起所述疾病的靶细菌是多重耐药细菌。编号的实施方案86包括实施方案1-85的方法，其中所述多重耐药细菌对至少一种抗生素具有抗性。编号的实施方案87包括实施方案1-86中任一项的方法，其中所述抗生素包括头孢菌素、氟喹诺酮、碳青霉烯、粘菌素、氨基糖苷、万古霉素、链霉素或甲氧西林。编号的实施方案88包括实施方案1-87中任一项的方法，其中引起所述细菌感染的靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。编号的实施方案89包括实施方案1-88的方法，其中引起所述疾病的靶细菌是假单胞菌属。编号的实施方案90包括实施方案1-89的方法，其中引起所述疾病的靶细菌是铜绿假单胞菌。编号的实施方案91包括实施方案1-90中任一项的方法，其中所述施用是动脉内、静脉内、尿道内、肌内、口服、皮
下、吸入或其任何组合。编号的实施方案92包括实施方案1-91中任一项的方法，其中所述个体是哺乳动物。编号的实施方案93包括实施方案1-92的噬菌体，所述噬菌体包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列，所述i型crispr-cas系统包含：(a)crispr阵列；(b)包含cas5、cas8c和cas7的cascade多肽；和(c)cas3多肽。编号的实施方案94包括实施方案1-93的噬菌体，其中所述crispr阵列包含间隔序列和至少一个重复序列。编号的实施方案95包括实施方案1-94的噬菌体，其中所述至少一个重复序列在其5’末端或其3’末端可操作地连接至所述间隔序列。编号的实施方案96包括实施方案1-95中任一项的噬菌体，其中所述间隔序列与靶细菌中的靶核苷酸序列互补。编号的实施方案97包括实施方案1-96的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含编码序列。编号的实施方案98包括实施方案1-97的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含非编码序列或基因间序列。编号的实施方案99包括实施方案1-98的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含启动子序列的全部或部分。编号的实施方案100包括实施方案1-99的噬菌体，其中所述靶核苷酸序列包含位于必需基因的转录区的编码链上的核苷酸序列的全部或部分。编号的实施方案101包括实施方案1-100的噬菌体，其中所述必需基因是tsf、acpp、gapa、infa、secy、csra、trmd、ftsa、fusa、glyq、eno、nusg、dnaa、dnas、phes、rplb、gltx、hiss、rplc、asps、gyrb、glns、dnae、rpoa、rpob、phet、infb、rpsc、rplf、alas、leus、sers、rpld、gyra或metk。编号的实施方案102包括实施方案1-101中任一项的噬菌体，其中所述核酸序列进一步包含启动子序列。编号的实施方案103包括实施方案1-102中任一项的噬菌体，其中仅通过所述噬菌体的裂解活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案104包括实施方案1-103中任一项的噬菌体，其中仅通过所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案105包括实施方案1-104中任一项的噬菌体，其中通过所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性相组合杀伤所述靶细菌。编号的实施方案106包括实施方案1-105中任一项的噬菌体，其中通过独立于所述噬菌体的裂解活性的所述crispr-cas系统的活性杀伤所述靶细菌。编号的实施方案107包括实施方案1-106中任一项的噬菌体，其中所述crispr-cas系统的活性补充或增强所述噬菌体的裂解活性。编号的实施方案108包括实施方案1-107中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体的裂解活性和所述crispr-cas系统的活性是协同的。编号的实施方案109包括实施方案1-108中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体的裂解活性、所述crispr-cas系统的活性或所述噬菌体的裂解活性与所述crispr-cas系统的活性两者均受所述噬菌体的浓度调节。编号的实施方案110包括实施方案1-109中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体感染多种细菌菌株。编号的实施方案111包括实施方案1-110中任一项的噬菌体，其中所述靶细菌是不动杆菌属物种、放线菌属物种、洋葱伯克霍尔德菌复合种、弯曲杆菌属物种、假丝酵母属物种、艰难梭菌、微细棒状杆菌、假白喉棒状杆菌、纹带棒状杆菌、棒状杆菌群g1、棒状杆菌群g2、肠杆菌科、肠球菌属物种、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、莫拉菌属物种、结核分枝杆菌复合种、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、非结核分枝杆菌物种、卟啉单胞菌属物种、产黑色素普雷沃氏菌、假单胞菌属物种、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、唾液葡萄球菌、缓症链球菌、血链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、霍乱弧菌、球孢子菌属物种、隐球酵母属物种、猫螺杆菌、幽门螺杆菌、鲍氏梭菌及其任何组合。编号的实施方案112包括实施方案1-111中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是专性裂解性噬菌体。编号的实施方案113包括实施方案1-112中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是获得裂解性的温和噬菌
体。编号的实施方案114包括实施方案1-113的噬菌体，其中通过溶原性基因的去除、替换或失活而使所述温和噬菌体获得裂解性。编号的实施方案115包括实施方案1-114中任一项的噬菌体，其中所述噬菌体是p1772、p2131、p2132、p2973、p4209、p1106、p1587、p1835、p2037、p2421、p2363、p4209、p004k或pb1。编号的实施方案116包括实施方案1-115中任一项的噬菌体，其中所述核酸序列插入非必需噬菌体基因中。编号的实施方案117包括一种药物组合物，其包含：(a)实施方案1-116中任一项的噬菌体；和(b)药学上可接受的赋形剂。编号的实施方案118包括实施方案117的药物组合物，其中所述药物组合物呈片剂、液体剂、糖浆剂、口服制剂、静脉内制剂、鼻内制剂、眼用制剂、耳用制剂、皮下制剂、可吸入性呼吸制剂、栓剂及其任何组合的形式。编号的实施方案119包括一种对有需要的表面进行消毒的方法，所述方法包括向所述表面施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(d)crispr阵列；(e)cascade多肽；和(f)cas3多肽，其中所述噬菌体包含实施方案1-118中任一项的噬菌体。编号的实施方案120包括实施方案119的方法，其中所述表面是医院表面、交通工具表面、设备表面或工业表面。编号的实施方案121包括一种防止食品或营养补充剂污染的方法，所述方法包括向食品或营养补充剂施用包含编码i型crispr-cas系统的核酸序列的噬菌体，所述i型crispr-cas系统包含：(g)crispr阵列；(h)cascade多肽；(i)cas3多肽，其中所述噬菌体包含实施方案1-120的噬菌体。编号的实施方案122包括实施方案121的方法，其中所述食品或营养补充剂包括奶、酸奶、凝乳、奶酪、发酵奶、基于奶的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于奶的粉末、婴儿配方食品或片剂、液体悬浮液、干口服补充剂、湿口服补充剂或干管喂养物。实施例实施例1：本应用中使用的工程化噬菌体
[0227]
噬菌体被工程化成包含cr阵列和cas构建体。表1a描述了在以下应用中使用的噬菌体的组分。表1b描述了用于驱动cr阵列和cas启动子表达的启动子的序列。表1c描述了cr阵列中用于靶向特异性位点的间隔序列的序列。此外，图1a-图1d描绘了在以下实施例中使用的cr阵列2-cr阵列5的序列和比对。组合的cr阵列3和假单胞菌i c型crispr插入片段的完整序列显示在图1e和表1d中。表1a：噬菌体的组分
表1b：启动子序列
表1c：间隔序列
表1d：cr阵列3-paic的序列
实施例2：外源性cas操纵子和crrna间隔序列杀伤细菌。
[0228]
用仅cas或含有crrna的质粒进行转化具有功能性i-c型cas操纵子的铜绿假单胞菌菌株。在存在内源性i-c型cas系统的情况下，crrna的表达会导致细菌自我靶向并降解其自身的dna。通过计数在具有对质粒特异的抗生素选择的琼脂板上生长的菌落数来确定转化体的数量。唯一能形成菌落的细菌是那些既能获得质粒又能在自我靶向情况下存活的细菌。这些数据表明，当内源性系统不存在时，外源性cas表达改善了内源性系统的自我靶向性和功能，如图2a所示。前两个图显示了将仅cas质粒、含有单个靶向性间隔序列的质粒或含有3-间隔序列靶向性阵列的质粒转化到含有内源性i-c型cas系统的菌株中的结果。在这个实验设置中，单个间隔序列或阵列与内源性cas系统一起作用并且足以杀伤大多数转化体。下部图显示，将外源性i-c型cas操纵子添加到crrna质粒在转化时进一步增强了杀伤，存在的细菌水平低于检测水平。
[0229]
将质粒转化到不含功能性i-c型cas操纵子的铜绿假单胞菌菌株中。转化的质粒要么单独表达间隔序列阵列，要么表达间隔序列阵列和i-c型cas操纵子。图2b显示了转化到铜绿假单胞菌菌株b1121的cas操纵子无效突变体中所获得的每ml细菌转化体的数量。阵列1靶向细菌，而阵列2是非靶向性对照。不同的质粒通过摩尔浓度标准化为空载体对照质粒。当用cas和靶向性阵列1转化细胞时，检测到的转化体数量减少。当与用空载体接收的转化体数量相比时，仅用靶向性阵列1或用cas和非靶向性阵列2转染的细胞未显示转化体数量减少。
[0230]
将含有单个间隔序列或独特阵列的质粒转化到具有内源性i-c型cas系统的铜绿假单胞菌菌株b1121中，或转化到同一菌株的cas操纵子无效突变体中。在b1121转染的细胞中观察到细胞死亡，但在cas操纵子无效突变体中没有观察到。这些数据，如图2c所示，表明靶向rpob和ftsa的单个间隔序列以及阵列3和阵列4能够与内源性i-c型cas系统一起作用而杀伤细胞。实施例3：用crispr-cas完整构建体工程化的噬菌体的稳定性
[0231]
图3a描绘了野生型噬菌体p1772及其工程化变体的基因组的示意图。基因组轴下方的条形表示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图说明了用于替换缺失区域中wt噬菌体基因的dna。crispr阵列cr阵列1、cr阵列3和cr阵列4靶向细菌，并有望在存在活性i-c型cas系统的情况下杀伤细菌。cr阵列2由非靶向性间隔序列制成，但在结构上与三个靶向性阵列相同，并用作展示i型cas特异性自我靶向活性的对照。
[0232]
携带crispr-cas3构建体的噬菌体被连续传代以评估噬菌体基因组中包含的重复序列的稳定性。p1772e005在铜绿假单胞菌菌株b1126(i-f型菌株)上连续扩增。进行扩增一到八作为一步扩增，其中将50μl的细菌过夜培养物添加到15ml离心管中的5ml lb中，然后立即添加1μl先前的裂解物。将混合物在振荡孵育器中于37℃生长10-16小时。孵育后，将噬菌体-细菌混合物以5,000rcf离心10min，将上清液通过0.45μm注射器过滤器过滤并储存在4℃。对于扩增九，将扩增八的连续十倍稀释液点样到菌株b1121或b1126的软琼脂覆盖层上。用移液管从每个板上挑取单个菌斑到200μl的pbs中，以获得扩增九。将十微升扩增九加入50μl b1121或b1126和5ml lb中过夜，然后生长约16小时，然后离心和过滤。对于桑格测序，使用工程化位点侧翼的引物通过pcr从裂解物中扩增噬菌体dna。桑格和ngs测序证实了在加载到噬菌体基因组时crispr-cas3构建体的稳定性和完整性(显示在图3b中)。
实施例4.具有crispr构建体的噬菌体形态
[0233]
将1.5ml粗裂解物在4℃和24,000
×
g离心1hr。轻轻弃去部分的上清液(约1.4ml)，将1ml乙酸铵(0.1m，ph 7.5)添加到剩余的裂解物中，然后将其离心。该步骤进行了两次。通过负染色透射电子显微镜可视化经洗涤的噬菌体样品。在25μl样品悬浮液的液滴上使辉光放电的热塑树脂(formvar)/碳涂覆的400目铜网格(ted pella,inc.，redding，ca)漂浮五分钟，快速转移到两滴去离子水中，然后一滴2％醋酸铀酰水溶液染色30秒。用滤纸吸干网格并风干。使用在80kv下运行的jeol jem-1230透射电子显微镜观察样品，并使用带有gatan microscopy suite 3.0软件的gatan orius sc1000 ccd相机拍摄图像。结果在图4中举例说明。修饰后噬菌体形态没有明显的可观察到的变化。实施例5.用crispr-cas完整构建体工程化的噬菌体的扩增
[0234]
将p1772wt(野生型)和工程化变体p1772e004(仅cas系统)和p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)以感染复数(moi)1与呈指数生长的b1126培养物混合。在感染后0min、15min、30min、1h、2h、4h、7h 10min和24h时，收集样品进行噬菌斑形成单位(pfu)计数(图5a-图5b)和rna分离和定量。对于pfu计数，将在每个时间点收集的样品通过0.45μm过滤器过滤，以将噬菌体从宿主细菌中分离。如幻灯片3所述制备软琼脂覆盖层。将10倍系列稀释的噬菌体样品点样在覆盖层上并在37℃孵育。第二天，对噬菌斑进行计数并用于计算初始样品中的pfu/ml。基于这些数据，没有观察到噬菌体生长模式的显著差异，并且每个噬菌体都达到了相似的最大滴度。
[0235]
p1772wt、p1772e004和p1772e005被稀释至颗粒数目1e6，每个单独的噬菌体用于以0.01的moi感染一组34种不同的细菌。在20小时的时间过程中，在波长600nm处每小时捕获光密度(od)读数。得到的od读数用于在三种噬菌体之一存在的情况下生成细菌生长曲线。积分用于计算每个生长曲线的曲线下面积(auc)，其中噬菌体添加后auc越小表明细菌负荷减少。通过随时间监测培养物的od600(浊度)来确定宿主范围，以获得细菌生长曲线，其中引入的噬菌体的起始量显示在图的底部(输入噬菌体滴度，以噬菌斑形成单位/毫升表示)。在存在和不存在噬菌体的情况下比较给定菌株的auc。图5c举例说明了auc比率，其中存在噬菌体时菌株生长的auc计算值除以在不存在噬菌体时菌株生长的auc。每行代表独特的细菌菌株。热图中较暗的值表示细菌负荷的减少幅度更大。如果(存在噬菌体时的auc)/(不存在噬菌体时的auc)小于0.65，则认为噬菌体感染给定菌株。auc比率的热图表明，在该测定中，工程化噬菌体变体具有与野生型亲本相当的宿主范围。p1772wt、p1772e004和p1772e005的宿主范围彼此相似，并且在测定的误差范围内。通过进行噬菌斑化对auc命中的宿主范围确认显示wt和crispr-cas3之间没有差异。
[0236]
表2显示了来自两个独特的包含完整构建体的经工程化噬菌体p阵列3(靶向性cr阵列3+cas系统)和p阵列4(靶向性cr阵列4+cas系统)的代表性生长实验的数据。在该测定中，通过用单个细菌菌落接种lb生长培养基并如“输入pfu/ml”列中所示添加噬菌体来进行扩增。将扩增孵育过夜。孵育后，通过过滤去除细菌，并通过软琼脂覆盖法定量裂解物中的噬菌体滴度。裂解物的滴度显示在“输出pfu/ml”列中。这些数据表明工程化噬菌体有效地复制。这些数据也证明了滴定测定的相对精度。表2：p阵列3和p阵列4的生长噬菌体名称复制输入pfu/ml输出pfu/ml倍数增加
p阵列313.00e+62.25e+9750p阵列321.90e+64.00e+92105p阵列411.00e+58.00e+980000p阵列425.00e+52.50e+95000实施例6.工程化噬菌体中的crispr-cas系统表达
[0237]
本实施例显示了从噬菌体基因组中成功表达了cas系统和cr阵列。图6a描绘了被工程化到p1772和本文所述的其他噬菌体中的间隔序列阵列(cr阵列)和cas操纵子的排列。箭头表示用于基因表达的定量逆转录pcr(qrt-pcr)分析的引物对的结合位置。
[0238]
不含cas操纵子的p1772wt(野生型)用作对照。对于rna分离，将在每个时间点收集的样品直接添加到rnaprotect。将样品在室温孵育5分钟，以5000x g离心10分钟，弃去上清液。将沉淀物储存在-80℃。然后使用qiagen rneasy微量制备试剂盒分离rna。使用biorad iscript cdna合成试剂盒合成cdna。使用biorad ssoadvanced universal sybr green supermix进行qrt-pcr。所有数据都是两个生物学重复的平均值。倍数变化是2-δδct
，使用铜绿假单胞菌基因rpsh作为管家基因，并将每个数据点与在同一时间点的仅有细胞的对照进行比较。
[0239]
图6b-图6d显示了在铜绿假单胞菌菌株被噬菌体p1772的不同变体感染后所示rna的相对表达水平。这些图中的数据表示为与不存在噬菌体的媒剂(vehicle)对照相比表达的倍数变化。将每个时间点标准化为该时间点的未感染对照。通过使用细菌看家基因rpsh对样品进行标准化来解释细菌浓度的变化。这些数据表明噬菌体在感染铜绿假单胞菌时产生cr阵列、cas3和cas8c转录物。图b-d中使用的细菌宿主含有内源性cas操纵子，因此p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)和p1772wt之间的差异代表了噬菌体介导的表达相比于内源性表达增加。
[0240]
图6e显示了来自不同的工程化噬菌体基因组的cas3mrna的相对表达。这些数据表明，在感染后1小时，来自p1772e005的cas3表达多于来自其他两种工程化噬菌体p2131e002(靶向性cr阵列1+cas系统)和p2132e002(靶向性cr阵列1+cas系统)的表达。然而，在感染后24小时，噬菌体表达接近相同数量的cas3。这些数据是通过比较cas3 rna表达与噬菌体gdna的量并在感染后1小时标准化为p1772e005来计算的。这些测定中使用的细菌菌株是cas无效菌株，因此内源性cas3表达没有贡献。实施例7.使用crispr-cas完整构建体进行工程化时的噬菌体裂解活性
[0241]
通过以下制备顶部琼脂覆盖层：将100μl的p1772指示菌株b1121的饱和过夜培养物与6ml的0.375％琼脂在含有10mm mgcl2和10mm cacl2的lb中混合。顶部琼脂凝固后，将2μl连续10倍稀释系列的p1772wt(野生型)和p1772e004(仅cas系统)和p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)点样在顶部琼脂的表面上。将板在37℃孵育约18小时，然后使用keyence bz-x800显微镜在4x和10x放大倍率下成像。图7说明了p1772噬菌体的改善的噬菌斑形态。观察到野生型噬菌体的形态产生模糊噬菌斑，而工程化变体p1772e005产生大小相似的噬菌斑，具有模糊晕圈但中心清晰。该数据表明p1772e005比p1772wt更彻底地杀伤细菌。实施例8：含有cr阵列和cas操纵子的噬菌体比仅含有cr阵列的噬菌体更有效地杀伤细菌
[0242]
p1772野生型和工程化噬菌体与细菌以对数生长混合，并立即铺板在lb琼脂上的2
μl点中。通过稀释系列改变了噬菌体与细菌的比例，使得细菌的数量在每次稀释时保持不变，但噬菌体的数量是1到4的稀释度。在最高稀释度时，感染复数(moi)为100，这意味着约100个噬菌体/细菌。在图8a中，p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)和p1772e006(仅靶向性cr阵列1)在过夜孵育后一致地杀伤i-c型菌株中存在的大部分细菌，如在这些点上很少或没有生长的细菌菌落所示，而野生型噬菌体不控制细菌菌落形成。因此，即使在moi为100时，野生型和p1772e004(仅cas系统)也无法控制细菌复制。图8b表明，由于细菌中的内源性cas系统，p1772e006在该菌株中比野生型更有效地杀伤该细菌，但它似乎不如还含有外源性cas系统的噬菌体(p1772e005)有效。这是因为随着孵育时间的延长，与p1772e005相比，暴露于p1772e006的点中形成菌落的细菌更多。
[0243]
图8c是来自图8a-8b中进行的相同类型测定的单个moi的定量。与图8ab-8b不同，图c中的细菌菌株没有内源性cas系统，但具有mcherry基因的基因组整合拷贝。对板进行成像并定量每个点的荧光。显示了moi为1.5的结果，但高于0.4的moi都具有与1.5的moi一致的结果。由于缺乏内源性cas系统，仅有cr阵列的噬菌体(p1772e006)的行为与野生型噬菌体相似。包含非靶向性cr阵列(p1772e008)的完全工程化的噬菌体相对野生型也没有得到改善。然而，与任何其他噬菌体变体相比，含有靶向性cr阵列(p1772e005)的完全工程化的噬菌体对细胞生长的抑制程度明显更大。该数据表明，完全工程化的变体不需要内源性cas系统即可有效。
[0244]
具有活性内源性i-c型cas系统的铜绿假单胞菌菌株(b1121)生长至对数中期，并在液体培养物中以指定的感染复数(moi)感染噬菌体。在所有情况下，噬菌体都成功杀伤了细菌，如图9a-9c所示，通过与未感染对照相比回收的菌落形成单位(cfu)/ml减少来表示。p1772e005(靶向性cr阵列1+cas系统)和p1772e006(仅靶向性cr阵列1)都比野生型噬菌体更有效地杀伤细菌。p1772e004(仅cas系统)相对于p1772wt(野生型)或自我靶向变体没有提高的活性，这表明自我靶向性crrna和i型crispr-cas组分都是提高噬菌体功效所必需的。值得注意的是，p1772e006和p1772e005杀伤至相同水平，这表明工程化噬菌体变体能够通过在存在相容且活性的cas系统的情况下从噬菌体中表达细菌靶向性cas系统来杀伤。这些图中的虚线表示该测定的检测限(lod)。未获得菌落的样品在lod处显示。实施例9：多种不同的铜绿假单胞菌靶向性间隔序列提高噬菌体功效
[0245]
p1772野生型和工程化噬菌体变体与表达mcherry的处于对数生长的细菌混合，并立即铺板到lb琼脂上。通过对噬菌体进行一系列稀释来改变噬菌体与细菌的比例，从而使每个点的细菌数量保持不变，但噬菌体的数量发生变化。最高感染复数(moi)为100，这意味着约100个噬菌体/细菌。过夜孵育后，通过明场和mcherry荧光对板进行成像来记录细菌生长。基于这些图像对样品进行定量。
[0246]
使用五种不同的噬菌体变体来确定裂解性噬菌体(其递送具有外源性i-c型cas系统的非靶向crrna(p1772e008)，没有外源性crispr-cas系统的仅自我靶向性crrna(p1772e006)，具有外源性i-c型cas系统的两种不同的自我靶向性cr阵列(p阵列3和p阵列4))和亲本野生型噬菌体(p1772wt)的效果。在这些测定中，将缺乏任何内源性cas系统的铜绿假单胞菌菌株和指定的噬菌体以指定的比例组合，并立即铺板到lb板上。这些测定中使用的宿主细菌菌株是cas-无效菌株并且具有染色体整合的mcherry基因，以通过测量相对荧光来促进细菌的观察和定量。结果描述在图10a-图10b中。较暗的点代表较高的细菌生
长。每个图像右侧的数字代表感染复数(moi)。在最高moi时，每1个细菌大约有100个噬菌体。这些板图像显示，在更高的moi时，噬菌体p阵列3和p阵列4(两p1772噬菌体都编码活性i-c型cas系统，并且每个都具有由三个不同的自我靶向性间隔序列构成的独特cr阵列)比p1772wt、具有cas操纵子和非靶向性间隔序列的噬菌体(p1772e008)或含有cr阵列但不含外源性cas系统的p1772(p1772e006)更有效地杀伤铜绿假单胞菌。正如预期的那样，仅有crrna的噬菌体(p1772e006)没有提高噬菌体功效，因为细菌没有内源性cas系统。
[0247]
图10c是图10a中方框的更高分辨率视图，并突出显示了完全工程化的噬菌体(p阵列3)与仅具有cr阵列并且没有cas操纵子的噬菌体(p1772e006)之间的差异。在底行(moi 0.00610)，p阵列3形成的噬菌斑比p1772e006更清晰(即p阵列3样品中的光点更亮)。在第一行(moi 0.0244)，p阵列3比p1772e006更好地抑制细菌生长(黑点)。
[0248]
图10d-图10e显示了图10a和图10b中所示相同板的相应荧光图像的第四行以下(moi约1.5)的定量，其定量了存在的荧光细菌的相对量。与明场图像一致，在moi约为1.5时，用p阵列3和p阵列4处理的样品比用野生型噬菌体或非靶向性(p1772e008)和仅有cr阵列(p1772e006)的工程化噬菌体处理样品具有显著更少的荧光信号(表明活细菌细胞的损失)。实施例10：具有不同启动子驱动cas操纵子表达的cr阵列/cas插入物的功效。
[0249]
p1772野生型和工程化噬菌体变体与表达mcherry的处于对数生长的细菌混合，并立即铺板到lb琼脂上。通过对噬菌体进行一系列稀释来改变噬菌体与细菌的比例，从而使每个点的细菌数量保持不变，但噬菌体的数量发生变化。最高感染复数(moi)为100，这意味着约100个噬菌体/细菌。过夜孵育后，通过明场和mcherry荧光对板进行成像来记录细菌生长。基于这些图像对样品进行定量。图11a显示了p1772野生型和包含由不同启动子表达的cas系统和cr阵列的噬菌体的多个工程化变体的细菌杀伤。所有工程化噬菌体变体都具有与p1772e005相同的结构(参见图3a)，并且仅在驱动cas操纵子表达的启动子的身份上有所不同。p1772e016使用了在铜绿假单胞菌中驱动内源性i-c型cas系统的启动子。p1772e005、p1772e017、p1772e021均使用大肠杆菌启动子或大肠杆菌细菌启动子的衍生物。p1772e018、p1772e022和p1772e023均使用铜绿假单胞菌细菌启动子。p1772e019和p1772e020使用铜绿假单胞菌噬菌体启动子。两个板来自相同的测定，对照(p1772wt和p1772e005)来自相同的噬菌体-细菌混合物，然后接种这些点。使用的细菌宿主菌株是从染色体表达mcherry的cas-无效铜绿假单胞菌菌株。使用4倍物镜和明场照明获取单个图像，然后拼接在一起以获得此处显示的图像。图11b显示了图11a中所示相同板的相应荧光图像的第四行以下(moi约1.5)的定量。在使用的不同启动子之间观察到总体功效的差异，这通过与p1772wt相比荧光信号(表明活细菌细胞的损失)显著减少来指示。实施例11：多种不同的噬菌体提高了针对log减少的功效
[0250]
野生型和工程化噬菌体变体与表达mcherry的处于对数生长的细菌混合，并立即铺板到lb琼脂上。显示的结果来自1.5的感染复数(moi)，这意味着约1.5个噬菌体/单个细菌。过夜孵育后，通过对板进行mcherry荧光成像来记录细菌生长。基于这些图像对样品进行如图12a-图12b所示的定量。测试了两种独特的野生型噬菌体(p2131和p2973)及其含有cas系统和cr阵列1的工程化对应物(p2132e002和p2973e002)。在moi为约1.5时，工程化噬菌体具有远少于野生型噬菌体的活细菌。这些结果表明，噬菌体递送的cas系统在多个独特
cfu是该特定菌株的理想接种物。在感染后3小时(pi)，通过在受感染的大腿中单次肌内注射，用媒剂(1x tbs+10mm盐)、p1772wt或p1772e005处理小鼠。左下的表详细说明了在每个实验中递送到每个受感染大腿的总pfu。对小鼠实施安乐死，并在接种后的指定时间点收获大腿肌肉。使用珠磨式研磨器对大腿进行匀浆化。匀浆被连续稀释并铺板用于cfu定量。还通过0.45um过滤器过滤匀浆。将滤液连续稀释并铺板用于在b1121覆盖板上进行pfu定量。所有cfu和pfu测量值均标准化为g组织。
[0254]
每个实验都显示了细菌菌落形成单位(cfu)和噬菌斑形成单位(pfu)。图15b-图15c显示了在肌内施用噬菌体的小鼠中的噬菌体功效。在指定的时间点收获大腿肌肉组织。两个重复都表明完全工程化的噬菌体比野生型噬菌体在更大程度上减少了定殖。图15d显示了在静脉内施用噬菌体的小鼠中的噬菌体功效。在指定的时间点收获大腿肌肉组织。完全工程化的噬菌体与野生型噬菌体相比对细菌的破坏程度更大。综合起来，来自图15b-15d的这些数据表明通过不同途径递送的噬菌体进入大腿并杀伤细菌。在每个时间点，用完全工程化的噬菌体处理的小鼠大腿组织的cfu/g低于用野生型噬菌体处理的小鼠。图15e是示意图，显示了在小鼠感染模型中建立噬菌体处理的剂量-响应模型的实验设计。该实验与图15a中所示的实验类似进行，但另外包括抗生素处理组以代表当前的标准护理。噬菌体剂量也在不同组之间滴定。
[0255]
图15f显示了用不同剂量的噬菌体或抗生素对小鼠进行处理的结果。总体而言，这些数据表明工程化的p1772e005在小鼠感染模型中比p1772wt更有效。此外，工程化噬菌体的表现优于给予的抗生素处理。在图b-d和f中，数据显示为平均值
±
sem。*p《0.05，**p《0.01，p《0.001，*p《0.0001。使用多重比较与单向anova，或tukey检验与双向anova来确定统计显著性。实施例14：大肠杆菌中的靶向性cr阵列
[0256]
图16显示了野生型噬菌体p004k及其工程化变体p004ke007的基因组示意图。基因组轴下方的条形表示基因组的被去除和替换的区域。噬菌体基因组下方的示意图说明了用于替换缺失区域中wt噬菌体基因的dna。
[0257]
大肠杆菌噬菌体p004k-wt(野生型)和p004ke007(靶向性cr阵列5+cas系统)与指定的细菌菌株在细菌呈对数生长时混合，并在接种后3小时铺板到lb琼脂上。通过对噬菌体进行一系列稀释来改变噬菌体与细菌的比例，从而使每个点的细菌数量保持不变，但噬菌体的数量发生变化。随着细菌复制并死于噬菌体，噬菌体和细菌的相对比例在实验过程中发生变化，这就是未列出moi的原因。每组图像顶部的标签表示显示的菌株。
[0258]
在该测定中，将噬菌体与所示中等对数生长的细菌培养物以1:1的比例混合，以获得图像左侧列出的最终噬菌体滴度。将细菌-噬菌体混合物孵育3小时，然后将2μl培养物点样到lb板上，如图17a中所示。在噬菌体中存活下来的细菌会复制形成可见的菌落，因此更少的细菌意味着更好的噬菌体杀伤。在该测定中，工程化噬菌体似乎在所有稀释度下都比野生型更好地杀伤细菌，但1x107稀释度对于每个大肠杆菌菌株而言在视觉上最引人注目。图17b-图17d显示了图17a中图像的定量。通过比较每个点的相对光密度(基本上每个点暗度如何，较暗的点表示更多的细胞生长)来确定定量。总之，这些数据表明，包含cas系统和靶向细菌基因组的cr阵列的工程化噬菌体在多个菌株中具有相比于野生型噬菌体亲本提高的杀伤力。这些数据表明，表达外源性cas系统的噬菌体提高了噬菌体针对多种人类病原
体的抵抗力。实施例15.体内功效研究
[0259]
b1121培养物生长过夜，反稀释进入lb+10mm mgcl2+10mm cacl2并生长至od600为0.45。将培养物分开并用lb/盐(仅有细胞的对照)、p1772e005(moi＝0.1)、pb1e002(moi＝0.1)或p1772e005+pb1e002的混合物(每个噬菌体的moi＝0.1)处理。所有样品均在微量滴定板中于37℃振荡孵育24小时，每10分钟测量630nm的od。数据表示为12次重复的平均值。误差条代表标准偏差。数据表明，两种完整构建体噬菌体的混合物比任何一种噬菌体本身都在更大程度上能抑制培养物反弹。图18a显示了p1772e005和pb1e002之间的协同性。实施例16：不同重复序列的活性
[0260]
用包含不同重复序列的载体转化铜绿假单胞菌培养物的培养物。载体是空载体pucp19(空载体)或包含pucp19载体，pucp19载体包含假单胞菌i c型cas系统和靶向gyrb基因的间隔序列，gyrb基因侧翼是表3中列出的重复序列。从每个测试条件中取出等分试样，稀释并点样以计数细菌cfu。表3：重复序列
[0261]
该测定的结果在图19中描述。特定序列导致不同数量的转化体。重复序列1和重复序列3都导致转化体的数量低于空载体或用重复序列2、4或5转化的细菌。这表明重复序列的序列影响假单胞菌培养物中噬菌体靶向的功效。实施例17：设计和验证间隔序列以靶向靶细菌间隔序列设计
[0262]
使用以下方案设计间隔序列。首先，获取目的生物体/物种/靶标的代表性基因组的合适搜索集。合适的数据库的示例包括ncbi genbank和patric(病理系统资源整合中心(pathosystems resource integration center))数据库。基因组通过ftp(文件传输协议)
服务器批量下载，从而实现快速和程序化的数据集采集。
[0263]
使用相关参数搜索基因组以定位合适的间隔序列。可以以正向和反向互补方向从起始到结束读取基因组，以定位包含pam(前间隔序列相邻基序)位点的连续dna段。间隔序列将是与pam位点的3'相邻的n长度dna序列，其中n特定于目的cas系统，并且通常提前知道。通常可以在cas系统的发现和初步研究期间执行pam序列和间隔序列的表征。每个观察到的pam相邻间隔序列都可以保存到文件和/或数据库中以供下游使用。
[0264]
接下来，使用以下过程确定在crispr工程化的噬菌体中使用的间隔序列的质量。首先，每个观察到的间隔序列可以被评估以确定它们存在于多少被评估的基因组中。另外可以评估观察到的间隔序列以确定它们在每个给定基因组中可能出现的次数。每个基因组在多于一个位置中出现间隔序列可能是有利的，因为如果发生突变，cas系统可能无法识别靶位点，并且每个另外的“备份”位点都会增加合适的、非突变靶位置存在的可能性。可以评估观察到的间隔序列以确定它们是否出现在基因组的功能注释区域中。如果此类信息可用，则可以进一步评估功能注释以确定基因组的这些区域是否对生物体的生存和功能“必需”。关注所有或几乎所有评估的目的基因组(》＝99)中出现的间隔序列可确保广泛的适用性来证明间隔序列选择的合理性。如果存在保守间隔序列的大选择池，则可以优先考虑出现在具有已知功能的基因组区中的间隔序列，如果这些基因组区对于生存“必需”并且每个基因组出现超过1次，则更优先考虑。间隔序列验证
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然后可以通过完成以下程序来验证鉴定的间隔序列。首先，鉴定在一种或多种目的生物体中复制并具有可选择性标记(例如抗生素抗性基因)的质粒。将编码cas系统的基因插入质粒中，以便它们在目的生物体中表达。在cas系统的上游包括启动子，所述启动子被目的生物体识别以驱动cas系统的表达。在启动子和cas系统之间，包括被目的生物体识别的核糖体结合位点(rbs)。
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接下来，将已在生物信息学上鉴定的靶向基因组的间隔序列插入到表达cas系统的质粒中。在重复序列-间隔序列-重复序列的上游包括被目的生物体识别以驱动crrna表达的启动子。此类启动子的示例列于表1b中。这种克隆必须在不被克隆的间隔序列靶向的生物体或菌株中进行。
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接下来，将非靶向性间隔序列插入到表达cas系统的质粒中。该间隔序列的序列可以随机生成，然后在生物信息学上确认在目的生物体的基因组中没有靶向位点。在重复序列-间隔序列-重复序列的上游包括被目的生物体识别以驱动crrna表达的启动子。
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接下来，确定每个测试的间隔序列的杀伤功效。表4中列出的质粒被标准化为相同的摩尔浓度。通过转化、接合或任何其他将质粒引入细胞的方法将每个质粒转移到目的生物体中。将转化的细胞铺板到适当的选择性培养基(例如含抗生素的琼脂)上。在细胞生长成菌落后，计数每个不同质粒转移产生的菌落。与含有非靶向性间隔序列的对照质粒相比具有显著更低转移率的含有靶向性间隔序列的质粒被认为成功靶向细菌基因组。表4：使用的质粒和对照
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虽然已经在本文示出和描述了本公开的优选实施方案，但是对本领域技术人员将是显而易见的，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本公开时可以采用本文所述的本公开实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同方案。

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