丁香假单胞菌噬菌体CXP1及其应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

丁香假单胞菌噬菌体cxp1及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域及生物防治领域，具体涉及一株丁香假单胞菌噬菌体cxp1及其应用。

背景技术：

2.细菌性疾病是困扰作物种植的主要问题之一,对这类病原菌的防治往往局限在使用抗生素或化学农药，但随之产生的细菌耐药性以及对绿色环保的需要,有必要探索新型高效的生物防治技术。
3.噬菌体是特异感染目标细菌并进行自我复制的一类病毒，烈性噬菌体具有宿主细菌特异性、自我复制、裂解能力强、对动植物没有毒性、环境友好和易于生产等优点，因此噬菌体疗法在细菌性病害的生物防治中具有巨大潜力。目前噬菌体已经在人类疾病，水产动物疾病及植物病害中有少量应用。但应用噬菌体制剂防治由丁香假单胞菌引起的植物病害还较为欠缺，探索开发对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种具有高效裂解能力，且安全性高、抗逆性强的噬菌体并非易事。该噬菌体的开发不仅积极配合我国农药减量的战略目标，还能够有效推动相关种植产业绿色可持续发展。

技术实现要素：

4.本发明筛选得到一种能够有效杀灭丁香假单胞菌而可应用于猕猴桃溃疡病生物防治的噬菌体。
5.本发明提供了一种丁香假单胞菌噬菌体（pseudomonas phage phi6）cxp1，噬菌体保藏号为cgmcc no.18918，于2020年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
6.本发明提供的丁香假单胞菌噬菌体是从土壤环境中分离得到的一株新的噬菌体，能够特异地感染并裂解丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，而不会杀死其他细菌，对正常菌群不会造成额外影响。噬菌体作为细菌病毒，不受细菌耐药性影响，在应用中也不引起药物残留等问题，具有安全性高和环境友好的特点，在猕猴桃溃疡病的生物防治中具有很好的应用前景。
7.因此，本发明提供所述丁香假单胞菌噬菌体cxp1在生物防治丁香假单胞菌所致植物病害中的应用。
8.优选地，所述丁香假单胞菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；所述植物病害是猕猴桃溃疡病。
9.同时，本发明也提供一种防治丁香假单胞菌所致植物病害的农业杀菌剂或其添加剂，或消毒剂/清洁剂。
10.作为优选，所述农业杀菌剂和消毒剂/清洁剂为已纯化的丁香假单胞菌噬菌体制备的单一制剂或以纯化噬菌体为主要成分制备的复配制剂，抑制丁香假单胞菌污染的多种产品的主要成分，包括农药添加剂、果园消毒剂和农具清洁剂等多种产品。
11.作为优选，所述丁香假单胞菌包括丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。更具体地，所述
丁香假单胞菌菌株编号为atcc 19875，所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种为atcc 700536和果园分离株psa-bj9。
12.本发明提供的一种防治丁香假单胞菌所致植物病害的方法，其是采用所述农业杀菌剂，对植物表面喷洒。具体的，喷洒于猕猴桃叶面，用于防治猕猴桃溃疡病。
13.本发明还提供了一种消毒剂或清洁剂用于防治果园环境中丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的污染的方法。作为优选，所述消毒剂或清洁剂的剂型为液体或冻干粉；所述果园环境包括植物体内（打吊瓶的方式注入植物体内）、植物表面、种植土壤、果园空气及地表水、农用器具。
14.本发明的丁香假单胞菌噬菌体在固体培养基上可以产生边缘清晰的透亮空斑，周围无晕环，培养12h后直径为2～3mm；经透射电子显微镜观察发现，该丁香假单胞菌噬菌体具有典型的球状结构，直径约60～80nm，经鉴定该丁香假单胞菌噬菌体属囊状噬菌体科，假单胞菌噬菌体phi 6。
15.通过实验测定上述丁香假单胞菌噬菌体的生物学特性，结果如下：1.通过最佳感染复数测定实验得出，该丁香假单胞菌噬菌体的感染复数为0.1，具较好的扩繁性能；2.通过一步生长曲线测定得出，该丁香假单胞菌噬菌体的潜伏期约为45min，爆发期约为55min，裂解量约为103，与同类噬菌体相比具有裂解量大的优势；3.ph、温度及紫外线稳定性实验结果表明，与同类噬菌体相比该丁香假单胞菌噬菌体具有更好的环境稳定性，在ph5-9的环境下性能较为稳定、当温度在50℃以下时活性稳定、对短时间紫外线照射有一定的耐受力；4.通过体外裂解实验得出，该丁香假单胞菌噬菌体对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（psa）有良好的裂解效果。
16.5.通过猕猴桃组培苗体内实验得出，叶片感染丁香假单胞菌10h后滴加106pfu/ml噬菌体cxp1，36h后能够显著减小叶片病变面积，降低病原菌浓度，治疗效果优于已报道的同类噬菌体。结果说明该丁香假单胞菌噬菌体可有效杀灭猕猴桃叶片所感染致病菌，对猕猴桃溃疡病具有较好的防治功能。
17.6.通过丁香假单胞菌噬菌体土壤消毒实验得出，使用106pfu/ml浓度的丁香假单胞菌噬菌体可有效的杀灭土壤环境中污染的宿主菌。
18.本发明提供了一株新发现的丁香假单胞菌噬菌体，能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有较好的理化因素耐受性、潜隐期短、裂解性能高、环境友好等特点，在猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。其易于制备喷洒液或淋洗液，应用于农药添加剂、消毒剂和清洁剂等。该噬菌体可制备成单一制剂使用，也具有与其他噬菌体复配制成噬菌体鸡尾酒的应用潜力。
19.附图说明
20.图1为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1噬菌斑照片；图2为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的透射电镜照片；图3为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的一步生长曲线；
图4为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的ph稳定性曲线；图5为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的热稳定性测曲线；图6为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的紫外线稳定性曲线；图7为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的体外裂解效果图；图8为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1的体内安全性测试结果；图9为本发明的丁香假单胞菌噬菌体cxp1对猕猴桃溃疡病的体内治疗实验结果；图10为本发明的提供丁香假单胞菌噬菌体cxp1的土壤消毒实验结果。
21.生物材料保藏信息：丁香假单胞菌噬菌体cxp1，于2020年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（简称为 cgmcc），地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其保藏编号为cgmcc no.18918，分类命名为假单胞菌噬菌体phi6（pseudomonas phage phi6）。
22.具体实施方式
23.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的丁香假单胞菌噬菌体及其应用，下面将对本发明实施例中的技术方案进行详细描述。所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不代表全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的分离纯化1.实验材料：猕猴桃枝条及果园土壤样品采集自四川省广元市苍溪县猕猴桃果园，噬菌体宿主菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种 psa-bj9，由本实验室从猕猴桃溃疡病发病枝条中分离、鉴定并保存。
25.2.实验方法：将1g果园土壤样品加入10ml无菌水，混匀后5000rpm离心20min，吸取上清液分别用0.45μm和0.22μm滤器过滤备用。取200μl上述滤液与200μlpsa-bj9菌液混合，加入10ml融化的半固体tsb培养基，混匀后倒在预先准备的tsb固体培养基平皿，制成双层平板。培养皿于25℃倒置培养12-16h，产生的空斑既含有可裂解psa-bj9的噬菌体。挑取空斑置于20mltsb液体培养基并加入100μlpsa-bj9菌液，25℃培养12h，离心过滤培养液再次使用双层平板法挑取单一空斑纯化该噬菌体。噬菌体的纯化需重复5次。纯化获得的噬菌体在固体培养基上可形成清晰规则的空斑，空斑直径2-3mm（如图1）。经全基因组测序获得该噬菌体序列信息，其基因组由三段rna组成，结合序列比对结果及电镜形态观察判断该噬菌体为假单胞菌噬菌体phi 6。
26.该噬菌体命名为丁香假单胞菌噬菌体cxp1，保藏号为cgmcc 18918，于2020年7月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：中国
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北京
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中国科学院微生物研究所，分类命名为假单胞菌噬菌体phi 6。
27.实施例2：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的大量增殖将3ml噬菌体cxp1原液和3ml宿主菌psa-bj9菌液加入200mltsb液体培养基中，25
℃震荡培养12h，12000rpm离心 30min，取上清，分别用0.45μm和0.22μm滤膜抽滤获得噬菌体的大量增殖液。用双层平板法检测噬菌体效价。
28.实施例3：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的透射电镜形态观察取10μl（109pfu/ml）纯化的噬菌体cxp1滴于铜网上，静置20min，滤纸吸去多余液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(pta)染色5min，用滤纸吸去残液，干燥后用透射电子显微镜观察。
29.丁香假单胞菌噬菌体cxp1的透射电镜结果如图2所示，该噬菌体呈球形，直径约为60～80nm。根据国际病毒分类委员会(ictv)《病毒分类-国际病毒分类委员会第十次报告》及全基因组测序结果（seq id no：1所示segment s、seq id no：2所示为segment m、seq id no：3所示为segment l）为标准，鉴定该噬菌体属于囊状噬菌体科，假单胞菌噬菌体phi 6。
30.实施例4：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的最佳感染复数测定首先制备丁香假单胞菌噬菌体cxp1增值液及对数期宿主菌psa-bj9菌液，分别进行计数测定浓度。按感染复数0.001、0 .01、0 .1、1、10和100的比例混合噬菌体及宿主菌，置于终体积为10ml的tsb培养液中。25℃震荡培养8h，12000rpm离心 30min，取上清，分别用0.45μm和0.22μm滤器过滤，获得噬菌体增殖液。用双层平板法检测噬菌体效价，根据测定结果判定最佳感染复数。
31.结果如表1所示，感染复数为0.1时，丁香假单胞菌噬菌体cxp1效价最高，为9.12
±
0.15
×
109pfu/ml。因此该噬菌体最佳感染复数为0.1。
32.表1丁香假单胞菌噬菌体cxp1的最佳感染复数测定结果感染复数噬菌体效价（pfu/ml）0.014.30
±
0.21
×
1070.19.12
±
0.15
×
10917.61
±
0.11
×
109106.25
±
0.08
×
1081004.23
±
0.15
×
108实施例5：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的一步生长曲线将丁香假单胞菌噬菌体cxp1与宿主菌psa-bj9各100μl按最佳感染复数0.1比例混匀，25℃孵育5min，12000rpm离心30s后使用tsb培养液清洗两遍，弃上清。加入10ml tsb培养液重悬沉淀（噬菌体终浓度为107pfu/ml），25℃震荡培养。分13个时间点取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体效价，绘制一步生长曲线，分析该噬菌体的潜伏期、爆发期及裂解量。
33.结果如图3所示，丁香假单胞菌噬菌体cxp1的潜伏期约为45min，爆发期约为55min，裂解量约为103。
34.实施例6：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的ph稳定性将丁香假单胞菌噬菌体cxp1分别置于10ml ph值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的tsb液体培养基，噬菌体终浓度为106pfu/ml。25℃放置1h后取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体cxp1的ph稳定性曲线。
35.结果如图4所示，丁香假单胞菌噬菌体cxp1效价在ph5-9范围内无明显变化。当ph《5或ph》9时，噬菌体cxp1效价随酸碱度的增加显著下降。噬菌体cxp1在ph=2处理组，效价降
低至103pfu/ml；在ph=12处理组，效价仅达到102pfu/ml。因此丁香假单胞菌噬菌体cxp1在ph5-9的环境下较稳定，具有较宽适用性。
36.实施例7：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的热稳定性使用tsb培养液稀释丁香假单胞菌噬菌体cxp1，使噬菌体终浓度为106pfu/ml。分别吸取10ml噬菌体稀释液，置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴中孵育1h，取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体cxp1效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体cxp1的热稳定性曲线。
37.结果如图5所示，丁香假单胞菌噬菌体cxp1效价在20-50℃环境下无明显变化。当温度超过50℃，该噬菌体的效价开始下降，在70℃处理组中，噬菌体cxp1的效价为102pfu/ml，下降4个数量级。因此在环境温度50℃以下，丁香假单胞菌噬菌体cxp1活性较稳定。
38.实施例8：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的紫外线稳定性将浓度为109pfu/ml的丁香假单胞菌噬菌体cxp1置于一次性平皿，放置在距紫外灯（20w, 50cm, 700mw/m2）下方40cm处照射。分别在照射处理后1min、5min、10min、15min、20min、30 min及45min取200μl噬菌体溶液，于黑暗环境静置30min后通过双层平板法测定噬菌体cxp1效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体cxp1的紫外线稳定性曲线。
39.结果如图6所示，丁香假单胞菌噬菌体cxp1在紫外线照射10min后，效价开始下降。照射20min后效价下降约一个数量级，当紫外线连续照射45min后，噬菌体效价下降至大约106pfu/ml。该结果表明丁香假单胞菌噬菌体cxp1对短时间紫外线照射有一定的耐受力。
40.实施例9：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的裂解谱检测选择丁香假单胞菌atcc 19875、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种atcc 700536、及6株分离自四川省苍溪县猕猴桃果园的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌株（psa-bj9、psa-bj11、psa-530、psa-540、psa-bst、psa-ndx）对丁香假单胞菌噬菌体cxp1的裂解谱进行测定。分别取待测宿主菌200μl均匀涂抹于tsb固体培养基平板，待菌液完全吸收后，滴加5μl噬菌体增殖液（109pfu/ml）于平板上，对照组滴加tsb液体培养基，待吸收后置于25℃恒温培养箱中倒置培养12h，观察是否产生噬菌斑。
41.结果表明待测的8株丁香假单胞菌于tsb平板上生长良好，滴加噬菌体cxp1区域无细菌生长，形成透明的空斑，裂解率为100%。
42.实施例10：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的体外裂解实验将丁香假单胞菌噬菌体cxp1分别与丁香假单胞菌atcc 19875、丁香假单胞菌猕猴桃致病变种atcc 700536及psa-bj9各100μl按最佳感染复数0.1混匀，25℃孵育5min，12000rpm离心30s后使用tsb培养液清洗两遍，弃上清。加入10ml tsb培养液重悬沉淀（噬菌体终浓度为109pfu/ml），25℃震荡培养。培养后0h、2h、4h、6h、8h、12h和16h检测培养液od600值，绘制噬菌体cxp1的体外裂解曲线。
43.结果如图7所示，丁香假单胞菌噬菌体cxp1在4h内能够有效裂解3株丁香假单胞菌，具有较好的应用前景。
44.实施例11：丁香假单胞菌噬菌体cxp1的体内安全性实验将6cm高猕猴桃组培苗分为3组，每组8株，每株组培苗选取3-5个叶片用无菌手术刀划出1cm左右伤口。高剂量组于叶片伤口滴加2μl浓度为108pfu/ml的噬菌体cxp1；低剂量组于叶片伤口滴加2μl浓度为106pfu/ml的噬菌体cxp1；对照组滴加2μl无菌tsb培养液。各
处理组在滴加噬菌体后0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h剪下3个叶片，取伤口周围1cm2叶片组织，加入1.5ml生理盐水研磨， 12000rpm离心3min，取上清分别通过0.45μm和0.22μm滤器过滤。吸取200μl滤液，双层平板法测定噬菌体cxp1效价，实验设置三次重复。
45.与对照组相比，噬菌体处理后叶片组织状态正常，对组培苗生长无负面影响。噬菌体效价检测结果如图8所示，高低剂量组噬菌体cxp1在叶片上均能够较稳定存在72h左右，72h后效价开始明显下降，120h降至0。结果表明，丁香假单胞菌噬菌体cxp1对猕猴桃组培苗具有良好的安全性，72h内能够在叶片上保持活性，120h后噬菌体残留完全清除。
46.实施例12：丁香假单胞菌噬菌体cxp1对猕猴桃溃疡病的体内治疗实验使用6cm高猕猴桃组培苗，每株组培苗选取3-5个叶片左右两侧用无菌手术刀划出1cm左右伤口。对照组（psa组）于叶片右侧伤口滴加2μl浓度为108cfu/ml病原菌psa-bj9；治疗组（cxp1组）首先于叶片左侧伤口滴加2μl浓度为108cfu/ml病原菌psa-bj9，感染10h后再滴加2μl浓度为106pfu/ml的噬菌体cxp1治疗。为防止液滴流动，叶片伤口处覆盖1cm2无菌纱布。36h后观察叶片病变情况，并取伤口周围1cm2叶片组织，加入1.5ml无菌生理盐水研磨，匀浆液10倍倍比稀释后进行菌落计数，对比两组叶片组织细菌浓度。实验设置三次重复。
47.结果如图9所示，同一叶片上，治疗组病变面积明显小于对照组。感染后36h菌落计数的结果显示噬菌体cxp1治疗后，细菌cfu显著下降，比对照组低3个数量级。因此丁香假单胞菌噬菌体cxp1在组培苗实验中，对病原菌psa-bj9引起的溃疡病有很好的治疗效果。
48.实施例13：丁香假单胞菌噬菌体cxp1土壤消毒实验在100g灭菌土壤中分别加入10ml丁香假单胞菌atcc 19875或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种psa-bj9（浓度为108cfu/ml），适当混匀后喷入10ml噬菌体cxp1（浓度为106pfu/ml），对照组喷入等量无菌tsb培养液。25℃放置2h后每组取1g土壤溶解于100ml无菌水进行菌落计数，检测细菌浓度。
49.如图10所示，土壤中丁香假单胞菌atcc 19875和psa-bj9经噬菌体cxp1处理2h后，细菌浓度均低于20 cfu/ml，而对照组则大于104cfu/ml。结果表明106pfu/ml浓度的噬菌体cxp1可有效杀灭土壤环境中污染的丁香假单胞菌及其猕猴桃致病变种。