宏基因组学在微生物抗生素抗性基因检测中的应

作者：张馨予

抗生素的使用已经成为全球广泛关注的热点，抗生素的广泛使用以及滥用造成了抗生素耐药性在微生物中的发展和传播[]，并且加速了全球多重耐药细菌和抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)的出现和传播[]。在医疗和农业中对抗生素的需求日益增加，这使得环境中细菌耐药性水平日益加剧，并且破坏了微生物和抗生素之间的自然平衡[]。

ARGs作为一种新型的环境污染物[]，广泛存在于人类、动物体内以及复杂的环境中。ARGs起源早于人类使用抗生素，抗生素耐药性是一种存在于环境中的古老的、自然发生的现象，从晚更新世(Late pleistocene)永久冻土沉积物中回收的DNA序列，确定存在四环素类(tetM)、万古霉素(vanX)以及β-内酰胺酶类(bla)抗性基因[]。人和动物会将未代谢完的抗生素及ARGs通过粪便和肠道细菌排放到环境中，环境中的耐药细菌会在抗生素选择压力下获得富集[]，或通过水平基因转移(Horizontal gene transfer，HGT)的方式将它们携带的ARGs传播到水原微生物中[]，造成ARGs在不同菌之间的传播，这些原因共同促成了ARGs在畜禽养殖废水、医院废水和生活污水中的聚集。然而食物链富集代表了一种特殊情况，在肉类生产和水产养殖过程中，可能会造成抗生素在组织细胞的富集，产生含有短暂而高浓度抗生素的细菌[]。

自1991年Pace首次提出环境基因组学(也称微生物环境基因组学、宏基因组学、生态组学)的概念，并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库以来[-]，发现ARGs在土壤[]、废水[-]、河水[]、饮用水[]、海水[]、沉积物[]等环境中广泛存在，尤其是水生生态系统(例如城市和医院废水)，是获取和传播ARGs的理想环境，甚至在动物源性食品[-]以及人体(例如肠道[-])中也检测到丰富的ARGs。总而言之，利用宏基因组学的方法，在很大程度上帮助我们更全面地了解不同环境中ARGs的多样性与丰度变化，对构建新的或完善目前已有的宏基因组文库，研究其对人类的潜在威胁具有重大意义，为未来获得基因的筛选比对提供了有力的参考。本文主要将宏基因组学在人类、动物和环境微生物中ARGs的检测应用以及重要意义进行了综述。

1 宏基因组学概述

宏基因组学(也称为环境和社区基因组学)是通过直接提取和克隆来自微生物组合的DNA来对微生物进行基因组分析。随着组学技术的发展，宏基因组学越来越多地被用于研究人类微生物群落以及环境中存在的ARGs，从而评估ARGs对人类健康的风险。宏基因组学领域大致可以分为两种不同的方法：基于序列的宏基因组学和功能性宏基因组学()[]。传统微生物学主要依赖于实验室对细菌的分离培养，然而，由于细菌分离培养较缓慢，且对细菌的生长基质选择与最适生长温度了解较少，所以目前环境中大多数的细菌不能通过培养的方式进行分离。董蕾等对金黄色葡萄球菌的检测方法研究进展进行综述，发现传统的检测方法已经不能适应现代化大规模的检测需要，而分子生物学方法研究更加快速、准确和灵敏[]，宏基因组学的发展，使得研究更加简便、高效、且特异性强，成本也在不断下降。

宏基因组学在微生物抗生素抗性基因检测中的应

图 1　微生物群落抗生素抗性的宏基因组学分析[] Figure 1　Metagenomic analysis of antibiotic resistance in microbial communities[]

基于测序的宏基因组学的技术路线主要包括：(1)直接从环境中提取DNA(包括未培养细菌)；(2)对DNA片段进行宏基因组测序；(3)将宏基因组序列与多年来在国家和国际数据库(参考序列)中累积的已知序列进行比较，以鉴定已知引起抗性的抗性基因和突变[]。功能性宏基因组学通常涉及宏基因组文库的构建，近几年功能性宏基因组学的应用与发展，证明了人类微生物群落中ARGs的储存库比以前依赖培养的方法所建立的更加多样化[]。功能宏基因组学的技术路线主要包括：(1)直接从环境中提取DNA(包括未培养细菌)；(2)将基因组DNA克隆到合适的载体中；(3)将载体转化到宿主细菌，构建宏基因组文库；(4)宏基因组文库的筛选和分析。利用功能性宏基因组学探索自然环境中的ARGs集合，可以揭示ARGs的真正多样性，确定新的耐药机制并揭示其生态作用。ARGs研究的目标包括确定：(1)抗生素耐药性是否是这些基因的主要功能；(2)它们与临床重要的耐药机制的关联；(3)它们的生物技术潜力[]。利用宏基因组学在微生物方面的研究越来越多，随着高通量测序技术的不断进步，基于测序的宏基因组学的应用尤为广泛，而对于ARGs传播机制与功能研究也不容忽视，只有充分认识到ARGs与抗生素耐药性之间的必然联系，才能够为未来ARGs可能对人类构成的健康威胁提供可靠地解决方法。