纳米抗体筛库案例

作者：杨超月

　　本项目为噬菌体展示纳米抗体文库的筛选案例，分为淘选、Phage ELISA筛选、Phage中和活性筛选、中和活性Soluble ELISA检测、进化树分析几步。

一、淘选

利用噬菌体展示A纳米抗体文库，针对A免疫抗原进行二轮体外定向筛选，结果如下所示。

Round Conditions Input Output Enriching factor
1st-P Target protein: A免疫抗原(5μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Neutralization: 1M Tris-HCl 1.13×1012 5.04×108 2.24×103
2nd-P Target protein: A免疫抗原(2μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk 1.18×1012 7.92×108 1.49×103
2nd-N Target protein: No Coating
Blocking: 2% Milk-PBST
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk 1.08×1011 3.04×104 3.55×106
3nd-P Target protein: A免疫抗原(2μg/mL)
Blocking: 2% Milk-PBST（预吸附）
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk 6.53×1011 7.77×109 0.84×102
3nd-N Target protein: No Coating
Blocking: 2% Milk-PBST（预吸附）
Washing: 0.1% Tween20-PBS, 15 times
Elution: 0.1M Glycine-HCl, pH2.5
Pre-counter select: 2% Milk 6.53×1011 3.5×106 1.87×105

二、Phage ELISA筛选

1.Phage上清的制备

（1）分别从第一轮和第二轮出库的平板上个挑取2板（94*2）个单克隆菌落至1ml的2×YT-AI-hp培养基中，37℃，200rpm摇菌过夜。

（2）5000 rpm，10min离心。小心吸取上清600 μl分装到1.5ml离心管，即为phage ELISA待测样品。

2.Phage ELISA检测

（1）包被：A，0.1μg/ml，包被，4℃ 过夜。

（2）封闭：2%脱脂奶粉封闭，200μL/孔，37℃1h。

（3）一抗：样品，10倍稀释，100ul/孔，37℃1h。

（4）二抗：Mouse anti HA tag mAb.1:10000,100μL/孔. 37℃1h。

（5）HRP：HRP conjugated Goat anti-Mouse IgG pAb 1:20000.100μL/孔. 37℃1h。

（6）显色：显色液.100ul/孔. 37℃.15min。

（7）终止：终止液.100ul/孔。

（8）读板：Antibody titer。

3.Phage ELISA检测结果

第一轮出库单克隆：

略

第二轮出库单克隆：

略

三、Phage中和活性筛选

分别挑取第一轮panning的43个阳性单克隆和第二轮panning的126个阳性单克隆Phage上清，进行中和活性检测。挑取的样品如下：

略

1.中和活性检测

（1）包被：A抗原, Recombinant，0.1μg/ml，100μL/孔，过夜。

（2）封闭：2%脱脂奶粉封闭，200 μL/孔，37℃1h。

（3）一抗：phage样品（一、二筛大于2），10倍稀释，100 μL/孔，37℃1h ， PBS作为对照。

（4）受体：A, Recombinant (His Tag), Biotinylated，0.1 μg/ml 100 μL/孔，37℃1h。

（5）二抗：SA-HRP（钟鼎抗体部内部产品），1：10000，100 μL/孔， 37℃1h。

（6）显色：100 μL/孔，37℃，15min。

（7）终止：100 μL/孔。

（8）读板：Antibody titer。

2.中和活性检测结果

略

挑取数值最低的30株（红色加亮），即中和活性最好的30株，安排测序。共获得7个unique sequence的克隆。

四.中和活性Soluble ELISA检测

1.周质腔可溶性蛋白制备

将上述7个unique克隆（in E.coli TG1），在37°C进行IPTG诱导表达，离心后收集菌体，进行周质腔可溶性蛋白抽提。

（1）从每管单克隆菌液吸取10 μL加入到1 mL 2×YT-AG（氨苄100 µg.ml-1和葡萄糖2%），37℃，220 rmp过夜。

（2）取0.4 ml过夜培养的单克隆菌液到20 ml的2xYT-AG（葡萄糖0.1%）中，37℃，220 rpm，培养约2.5 h，至对数生长期。

（3）3000 rpm离心15 min弃上清。加入20ml的2×YT-AI（IPTG终浓度为1mM），30°C，200 rpm过夜。

（4）3000 rpm，离心15 min，丢弃上清，用0.5 ml 预冷1×TES重悬沉淀，冰上放置15 min，再加入 0.75 ml 预冷 1/5 × TES，充分混匀。冰上放置30 min。

（5）13,000 rpm ，4 °C，10 min离心，小心吸取上清转移到新的离心管，即为周质上清。