外泌体：分离方法和特异性标记物

作者：张馨予

外泌体分离方法

从生物体液分离外泌体的各种方法已被开发出来。它们包括离心，色谱，过滤，基于聚合物的沉淀和免疫学分离。这些方法最近的技术进步使分离过程更快更容易。非外泌体颗粒造成的分离后的外泌体污染可导致关于获得的外泌体生物活性的错误结论，因此应该避免。来自不同标本的外泌体可能拥有不同的蛋白质或脂类，管腔内容物和不同的沉积特征。

分离方法机制优点弱点
差速离心该方法由几个离心步骤组成，旨在去除细胞，大囊泡和碎片，沉淀外泌体。差速离心是用于从生物体液和培养基分离外泌体的标准和非常普遍的方法。当粘性生物体液诸如血浆和血清用于分析时，此方法的效率较低。
密度梯度离心这种方法以蔗糖密度梯度超速离心。该方法允许从其他囊泡，颗粒和污染物中分离低密度外泌体。对离心时间非常敏感。
体积排阻层析体积排阻层析分离基于它们的大小。它使用填充有多孔聚合珠的柱子。该方法允许大小分子的精确分离，和不同溶液的应用。相比离心方法，通过色谱分离的外泌体的结构不会受到剪切力的影响。该方法需要很长的运行时间，这限制了色谱分离法在处理多个生物样品时的应用。
过滤超滤膜用于从蛋白质和其它大分子分离外泌体。外泌体群集中在膜上。过滤允许小颗粒和可溶性分子分离自外泌体。在此过程中外泌体群富集于滤膜。外泌体可能附着在过滤膜，下面的分析步骤就流失了。另外，由于待分析的液体通过膜时施加了额外的力，外泌体可能变形或损坏。
基于聚合物的沉淀该技术包括生物体液和含聚合物的沉淀溶液的混合，保温步骤和低速离心。沉淀的优点包括对分离外泌体的温和作用和使用中性pH。基于聚合物的沉淀法共分离了非囊泡污染物，包括脂蛋白。此外，聚合物材料的存在可能与下游分析不能兼容。
免疫分离应用各种免疫学方法。结合了特异性抗体的磁珠用于分离外泌体。此外，基于ELISA的分离方法也有发展。该方法允许所有外泌体或外泌体的选择性亚型的分离。此外，它也适用于外泌体蛋白质的定性和定量。该方法不适用于大量样品。此外，分离的囊泡可能失去功能活性。
通过筛分隔离该技术通过膜筛分外泌体和由压力或电泳进行过滤。相对较短的分离时间，并分离到高纯度的外泌体。

分离的外泌体回收率低。

表一：外泌体分离方法。

差速离心

差速离心仍是外泌体分离的最常见技术之一。该方法有几个步骤，包括：1）低速离心以除去细胞和细胞凋亡碎片，2）高速离心以消除大囊泡和3）高速离心以沉淀外泌体（图1）。重要的是，生物体液的粘度与分离的外泌体的纯度有显著的相关性 [] 。而且，高粘度的生物样品需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度。

外泌体：分离方法和特异性标记物图 1

图 1. 差速离心。分离外泌体需几轮离心。连续两轮的离心时间增加以沉淀较小的颗粒。每次离心后，将含有细胞碎片的沉淀物除去，上清液用于下一步骤。与此相反，100000×g离心后，保留外泌体颗粒用于进一步的分析，并且除去上清液 [] 。

密度梯度离心

此方法以蔗糖密度梯度超速离心 [] 。更具体地说，密度梯度离心用于从非囊泡粒子，如蛋白质，蛋白质/ RNA的聚集体中分离外泌体。因此，这种方法从不同密度的颗粒分离出囊泡。充足的离心时间是非常重要的，否则如果外泌体和颗粒密度相似，外泌体部分可以仍然发现颗粒污染。最近的研究建议进行离心前把超速离心得到的外泌体沉淀加到蔗糖梯度 [] 。

外泌体：分离方法和特异性标记物图 2

图 2. 旨在分离外泌体的纤毛多孔结构。该结构让细胞和其他大于1微米的颗粒不能进入有线区域。一些较小的颗粒和细胞碎片可以进入微柱区域，但排除在纳柱区域外，上面有直径30-200纳米的孔。纤毛结构选择性地捕获外泌体和小的胞外囊泡 [] 。

体积排阻层析