解析m6A RNA甲基化修饰实验思路
今天和大家分享一篇于2021年7月发表在Cell Death and Disease上的文章"The m6A mRNA demethylase FTO in granulosa cells retards FOS-dependent ovarian aging"，颗粒细胞中m6A mRNA脱甲基酶FTO延缓FOS依赖的卵巢衰老。在文章中，作者通过多种实验方法揭示了FTO在卵巢衰老中的作用。通过对这篇文章的学习，我们一起来解析一下m6A RNA甲基化修饰的实验思路~
一、m6A RNA甲基化修饰
20世纪70年代初期，Desrosiers等在Novikoff肝癌细胞的信使RNA(messenger RNA，mRNA)中发现并提出了一种新的RNA表观遗传修饰方式——N6-腺苷甲基化(N6-methyladenosine，m6A)。m6A修饰属于表观遗传学范畴，即腺嘌呤碱基A的第6位N原子发生甲基化，目前被认为是最普遍、最丰富和最保守的RNA内部修饰方式。
RNA的m6A修饰涉及三种类型的蛋白质：甲基转移酶(writer)、脱甲基酶(eraser)和m6A结合蛋白(reader)。
m6A甲基化修饰对多种生物过程有着重要意义，以凋亡为例，m6A修饰参与其中多条信号通路。
在m6A的多种检测方法中，MeRIP-seq是目前运用最多的方法，它的全称是甲基化RNA免疫共沉淀高通量测序。其原理是通过m6A抗体富集在发生m6A甲基化的RNA片段，再对沉淀下来的RNA片段进行高通量测序，在全转录组范围内研究发生m6A甲基化修饰的区域，进而开展下游的研究。
在了解了m6A RNA甲基化修饰之后，如何开展与之相对应的研究呢？下图展示了m6A实验研究的一般思路，即首先通过数据挖掘和早期的实验数据表明所要研究的疾病与m6A RNA甲基化修饰存在关系，在锚定了相关甲基化酶的情况下，对相关酶进行敲除或过表达，并结合转录组测序锁定差异表达基因。锁定靶基因后再通过靶基因的敲除和过表达对基因功能进行验证，并通过motif点突变证实靶基因直接受到相关甲基化酶的调控。
学习了m6A RNA甲基化的实验思路之后，下面我们通过一篇案例文章，进一步来领悟m6A RNA甲基化实验研究。
二、文章背景
探讨女性卵巢衰老的病理生理机制和女性不育的发病机制具有重要的现实意义，然而参与卵巢衰老过程的基因表达转录后调控尚未被充分研究，并且RNA m6A修饰在生殖生理和病理中的许多方面，特别是在卵巢衰老过程中的修饰尚未得到充分阐明。
因此，作者设计这项研究来确定m6A在卵巢衰老过程中的作用。衰老卵巢GCs中m6A总含量增加，关键修饰酶表达水平发生变化，即脱甲基酶FTO下调，其下游关键靶基因被确定为强效转录因子亚基和衰老相关蛋白FOS。FOS-mRNA-3‘UTR中m6A的增加破坏了FOS-mRNA的正常降解过程，从而导致FOS水平的增加，进而导致GCs的衰老。
实验中卵巢衰老的纳入和排除标准是基于欧洲人类生殖及胚胎学会公布的博洛尼亚卵巢反应不良标准确立的。
三、实验方法
本篇文章中用到的实验方法包括检测m6A RNA修饰的MeRIP-seq、mRNA-seq、点印记法，敲除基因用到的慢病毒的产生和基因转导，motif点突变验证用到的荧光素酶报告基因分析和突变分析，以及验证基因功能用到的染色和蛋白定量分析。
四、实验结果
1.衰老卵巢GCs中m6A修饰异常增加是由于脱甲基酶FTO下调所致
为了检测卵巢衰老过程和m6A修饰之间的关系, 用比色法检测衰老卵巢和对照卵巢GCs的总m6A修饰,衰老卵巢的GCs总RNA m6A的数量明显高于正常卵巢(图1 A)。由于m6A是由一系列甲基酶/脱甲基酶如METTL3、METTL4、METTL14、WTAP、KIAA1429、ALKBH5、FTO等写/抹去的，为了确定是哪个基因主要导致了m6A的增加，作者进行了real-time PCR (RT-PCR)。结果表明，在衰老卵巢GCs中FTO表达下调，而METTL3，METTL4, METTL14, WTAP,和KIAA1429的表达,没有显著不同(图1 B),并通过查询proteinatlas数据库(https://www.proteinatlas.org/)发现在GCs中存在FTO的特定高表达 (图1 C)。Western blotting(图1 D)和免疫荧光(图1 E)检测GCs中FTO的蛋白水平，发现FTO在衰老卵巢GCs中表达下降。为研究FTO基因敲除是否能介导GCs的衰老过程，用含50µm过氧化氢的培养基诱导GC的衰老过程。与阴性对照组相比，FTO敲除组的γ H2A.X（衰老标志）的表达增加 (图1 F)， β-半乳糖苷酶染色在COV434-shFTO和KGN-shFTO细胞中也增加(图1 G)。上述结果提示GCs中的FTO可能在卵巢衰老过程中发挥重要作用。
Fig. 1 Levels of RNA m6A and expression of FTO in GCs of OA patients and controls.
2. 甲基化RNA免疫沉淀测序揭示了颗粒细胞中FTO潜在的m6A靶点
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