冷冻电镜技术原理及发展

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　冷冻电镜全称冷冻电子显微镜（Cryoelectron Microscopy），简单理解为用电子显微镜去观察冷冻固定的样本，得出清晰三维结构。可实现直接观察液体、半液体及对电子束敏感的样品，如生物、高分子材料等。

　　左边是2013年前人们能得到的分子图像，右边是冷冻电镜技术的结果

新冠肺炎病毒模型图

　　1. 什么是冷冻电子显微镜技术

　　冷冻电子显微镜技术，也叫冷冻电镜技术，是在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，即把样品冻起来并保持低温放进显微镜里面，用高度相干的电子作为光源从上面照下来，透过样品和附近的冰层，受到散射。我们再利用探测器和透镜系统把散射信号成像记录下来，最后进行信号处理，得到样品的结构。冷冻电镜技术作为一种重要的结构生物学研究方法，它与X射线晶体学、核磁共振一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础。这项技术获得了2017年的诺贝尔化学奖。获奖理由是“开发出冷冻电子显微镜技术(也称为低温电子显微镜技术)用于确定溶液中的生物分子的高分辨率结构”，简化了生物细胞的成像过程，提高了成像质量。

　　2. 冷冻电子显微镜成像原理

　　在光学显微镜下，可见光穿过标本就会通过光学透镜进行折射形成图像。电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是电子显微镜采用电子束作光源，采用80-300kV电子束加速电压，用电磁场作透镜。两者的主要区别是分辨率不同，而影响分辨率的直接因素是光源的波长，即波长越短，分辨率越高。光子的波长大概在500nm左右。电子的波长是光子波长的十万分之一左右。1975年，Henderson通过电子显微镜首次解析得到了分辨率为0.7nm的细菌视紫红质的结构，这些开拓性的研究最终确定了细菌视紫红质以及其他膜蛋白，如水通道蛋白的近原子分辨率图。这些研究为许多二十面体病毒的原子分辨率模型的生成奠定了基础。非有机样品的分辨率甚至更高，它们在成像过程中承受的电子剂量比生物材料高得多，而且结构完整。

　　那么，为什么不能在原子分辨率的电子显微镜下，直接对单个蛋白质、病毒和细胞的自然状态进行常规成像呢?

　　在传统的透射电镜下，一般采用使用负染色法来减轻损伤，即在可接触的分子表面涂上含有重原子的试剂，如醋酸铀酰，这种试剂的辐射敏感性比有机物低得多。通常形成的细胞、病毒和蛋白质图像分辨率在2-4 nm。对未染色标本进行高分辨率成像的困难在于，为了使损伤最小化所降低的电子剂量，会产生噪声图像，而电子剂量高到足以获得良好的信噪比时，则会导致标本损伤达到不可接受的程度。

　　为了解决上述为题，冷冻电镜技术采用了以下两种方法，第一种方法是使用保存在液氮或液氦温度下的冷冻标本进行成像。近40年来，对室温下衍射强度与低温下衍射强度衰减的测量表明，低温电子显微镜可以降低辐射损伤的影响。采用一种在一层玻璃态冰中快速冷冻(玻璃化)生物标本，然后在液氮或氦气温度下成像的方法，使得低温电镜技术得到广泛应用。将水溶液注入液氮冷却的乙烷等冷冻液中，是一种用于制备用于层析成像、单颗粒成像以及螺旋和二维晶体的冷冻电子显微镜样品的方法。与室温下相比，在液氮温度下成像可以减少多达六倍的辐射损伤。这意味着每单位电子剂量的辐射损伤减少，对于低温下记录的图像，可以使用更高的电子剂量来增加信噪比。事实上，液氮和液氦都被成功地用于近原子分辨率的三维重建，在它们的冷却下，分辨率可达大约0.4到2 nm。第二种提高信噪比的方法是对大量同一生物标本单元的图像进行平均。该技术首次应用于螺旋组装体和二维蛋白晶体的室温成像及低温成像。这两个概念，即低温成像的概念和多幅低剂量图像平均的概念，构成了现代高分辨率生物电子显微镜的基础。