1a与ROS“老元素”携手也能冲心血管高分

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　2021年11月澳大利亚Victor Chang心脏研究所Richard P. Harvey团队与Vaibhao Janbandhu等人合作在Cell Stem Cell上发表题目为“Hif-1a suppresses ROS-induced proliferation of cardiac fibroblasts following myocardial infarction”的心血管文章，该研究发现HIF-1a能够抑制心肌梗死后ROS增加介导的心脏成纤维细胞增殖所致心肌纤维化扩张的现象。该发现为心血管疾病的治疗提供了新的药物靶点和研究方向。

　　缺氧诱导因子1(HIF-1)通路一直在心血管生物学领域中发挥重要作用。妊娠期生理性缺氧激活局部HIF-1通路，对心脏的腔室和室间隔形态发育至关重要。成人心脏经历周期性的缺氧，包括生理上在高海拔和运动期间以及病理上在缺血期间、心肌细胞肥大、炎症和纤维化期间的缺氧，这些情况可能与ROS水平升高和氧化损伤有关。

　　机体通过HIF-1通路适应缺氧微环境，HIF-1α属于bHLH-PAS (basic-helix-loop-helix-Per-Arnt-Sim) 家族的转录因子。缺氧条件下HIF-1a亚基稳定并易位到细胞核，异二聚后激活下游基因通路，减少氧消耗和活性氧(ROS)生成，并恢复氧递送。

　　HIF-1在心脏中的作用的研究主要集中在心肌细胞上，且其在ECM重构和缺血预适应以及动脉粥样硬化进程中的作用已被证实。但HIF-1在心脏成纤维细胞中的功能尚未被阐明。心脏成纤维细胞是一种异质性的基质细胞群，通过控制细胞外基质的沉积和周转来促进心脏的生物力学完整性，并介导心脏修复和再生中的适应性纤维化。心脏成纤维细胞几乎与所有形式的心血管病理表型相关如：ECM分泌与收缩、纤维化与疤痕形成、心力衰竭等。

　　亮点要素

　　1.缺氧诱导PDGFRa+/SCA1+的心脏成纤维细胞表达Hif-1a

　　2.Hif-1a的缺失能够降低心脏成纤维细胞激活的阈值

　　3.敲除Hif-1a导致缺血损伤后ROS增加和过度纤维化

　　4.Hif-1a或可限制线粒体ROS生成及心脏成纤维细胞的增殖

　　研究思路

　　通过对未损伤的小鼠S+P+阳性的CFs采用流式等分析，发现该种类细胞在缺氧状态下的代谢更倾向于糖酵解途径而非常规的线粒体氧化磷酸化途径，由此发现CFs不同于CMs的代谢谱差异。（现象挖掘）

　　HIF-1a在缺氧状态下CFs中高表达，其靶基因能在正常的氧化磷酸化中促进糖酵解途径，通过scRNA-seq结果与HIF-1靶基因数据库的比对确定HIF-1的靶基因是同样在缺氧CFs中高表达的MEIS1。（锁定目标）

　　体外利用与CFs类似的cCFU-Fs成纤维细胞系，验证线粒体质量低的细胞具有和CFs类似的增殖能力；体内构建CFs特异性Hif-1a敲除小鼠验证其在CFs稳态和心脏疾病中的作用。（体内外验证）

　　通过整理并利用qRT-PCR逐一验证与HIF-1相关的机制如糖酵解、血管生成、氧化还原稳态等，最终将HIF-1作用机制确定为调节线粒体氧化应激。（关联机制验证）

　　通过ROS探针等验证在缺氧CFs中HIF-1α调节氧化应激降低线粒体ROS，进而抑制由ROS介导PI3K/AKT/mTOR及MAPK、ERK1/2等通路激活导致的CFs增殖。（机制串联）

　　研究内容

　　首先分离正常小鼠心脏中 SCA1+/PDGFRa+/CD31-的CFs，在低氧状态下通过Pim染色流式分析发现S+P+细胞缺氧程度高于其他非心肌细胞群，其氧消耗及ATP水平远低于其他非心肌细胞群。但其葡萄糖消耗速率及细胞内乳酸水平却更高，提示S+P+细胞的代谢更倾向于糖酵解途径而非常规的线粒体氧化磷酸化途径，与之相对应的S+P+细胞的线粒体质量同样偏低。HIF-1a及其靶基因在S+P+细胞中高表达，已知HIF-1a的靶基因能在氧化磷酸化中促进糖酵解，随后通过已发表的scRNA-seq结果与HIF-1靶基因数据库的比对确定HIF-1a的靶基因MEIS1。又进一步对线粒体质量差异的细胞进行增殖能力的对比，发现低线粒体质量的细胞增殖能力更强，这也与缺氧状态下CFs的增殖现象相符合。

　　图1.成年小鼠心脏中S+P+细胞的代谢谱

　　为了探索HIF-1a在心脏成纤维细胞稳态和疾病中的作用，研究者构建了CF特异性HIF-1a他莫昔芬诱导的条件性敲除小鼠并对其心脏中CF进行测序。发现cKO小鼠下调的差异基因与发表的HIF-1靶基因存在交集，且GOterm分析显示，HIF-1相关靶点参与了增殖等细胞功能的调控，其他少数上调的基因与炎症、蛋白水解和应激等途径有关。接下来为了研究cKO小鼠在心脏损伤后CFs的增殖情况，研究者构建了心肌梗死模型并利用EdU追踪增殖细胞。MI手术3天时在梗死区观察到EdU+细胞，7天时延伸至梗死边界区，而谱系阴性小鼠无变化。提示CFs中Hif-1a的缺失可导致心肌梗死后成纤维细胞增殖增加。

　　图2.心肌梗死后hif-1a缺失的CFs的增殖能力有缺陷