细胞自噬检测试剂盒(MDC染色法)

作者：杨超月

自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。自噬是溶酶体介导的胞内降解途径，是真核细胞在恶劣环境(比如营养缺乏)威胁时引发的降解和细胞内容物再循环的过程。这一途径在对各种应激条件进行应答从而在促进细胞内环境平衡、能量平衡和细胞存活上具有重要的作用，更多的证据表明自噬功能与多种疾病密切相关，包括癌症、神经退行性疾病、糖尿病、自身免疫性疾病和心血管疾病。
细胞自噬检测试剂盒是采用MDC染色法染色细胞内自噬体的检测试剂盒，该产品可代替传统LC3-GFP法，通过荧光示踪物来选择性检测自噬通路中的各种囊泡包括自噬前体、自噬体和自溶酶体，用于流式细胞仪，无需转染，就能在荧光显微镜下跟踪活细胞的自噬过程进行定量分析，或用流式细胞仪进行高通量筛选，甚至能标记原代细胞。并且该产品可以进行自噬通路的动力学分析，为研究者展现自噬体形成和消除之间的动态平衡。
细胞自噬检测试剂盒中的MDC自噬体染色探针为绿色荧光标记的自噬体探针，具有335nm/518nm的最大激发/发射波长。

储存条件：染料-20℃避光保存；避免反复冻融；缓冲液2-8℃保存。
有效期：一年。

※ ※ ※使用前请仔细阅读产品说明书※ ※ ※
使用限制：本试剂仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

产品特点：
● 无需转染，可在活细胞内定量检测细胞自噬情况，可在活细胞内定量检测自噬小泡和监控活细胞自噬流(自噬体的合成、自噬底物到溶酶体的运输、自噬底物在溶酶体的降解过程)；
● 适用于流式细胞检测和显微镜分析；
●可用于高通量筛选自噬的激活剂和抑制剂；
●可选择性地对前自噬体、自噬体和自噬性溶酶体进行染色，而对溶酶体染色较少。

试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ●离心机●荧光显微镜/激光共聚焦显微镜/荧光酶标仪等

使用方法：

使用注意事项：
● MDC染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
●细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
●标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
●染色后立即进行分析。

1．染色工作液配制：
根据样本数量，用检测缓冲液将MDC荧光染料10倍稀释，再用相应的培养基或者HBSS缓冲液40-200倍稀释，配制成染色工作液。
【注】:
● 也可以直接用相应的培养基或HBSS等缓冲液稀释MDC染料至所需浓度。
● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。开始实验前，使用培养基或HBSS缓冲液稀释储存液到需要的工作浓度。
工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度400-2000倍稀释。
● 工作液现配现用。
● 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
2．细胞染色
2.1对于贴壁细胞
1)将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
2)待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含MDC探针工作液。于生长状态下孵育15分钟-1小时(具体孵育时间需根据细胞类型而定)。
3)利用新鲜培养基或PBS替换上述染色液并在荧光显微镜(含合适滤片)下观察。
【注】:
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
2.2对于悬浮细胞
1)离心，吸除上清。
2)利用37℃预热的探针工作液重悬细胞，于生长状态下孵育15分钟～1小时(具体时间需根据细胞类型而定)。
3)离心，吸除染色液，加入新鲜培养液或PBS重悬细胞。
4)置于荧光镜下观察或流式检测。
【注】:
●对于悬浮细胞，也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上，然后使用类似于贴壁细胞的方法进行染色。
● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
3．观察结果：
在荧光显微镜(含合适滤片)/酶标仪/流式细胞仪下观察细胞。
最大激发/发射波长为335/518nm。
相关搜索：细胞自噬检测试剂盒(MDC染色法)