限制性内切核酸酶_分子生物学实验指

作者：张馨予

限制性内切核酸酶_分子生物学实验指

第一节　限制性内切核酸酶

在DNA重组及核酸杂交等技术中，分子生物学家需利用一些基本的工具酶对DNA和RNA进行操作。例如:对目的基因进行操作时，需限制酶在准确的位置切割，使较大的DNA分子成为一定大小的片段;构建重组DNA分子时，必须在DNA连接酶的催化下，才能使DNA片段与载体共价连接。此外还有一些DNA修饰酶和RNA修饰酶也是进行DNA和RNA操作时所必不可少的，比如DNA聚合酶、逆转录酶、RNA聚合酶、RNA连接酶、末端转移酶、核酸酶及磷酸酶等。本章重点介绍这些酶类的性质及其基本原理和实验方案。

本章共分五部分。第一部分介绍限制性内切核酸酶的功能与特性，酶切的基本方法及影响酶切效率的因素。对每种商品酶的识别序列、反应条件及热灭活条件也进行了较为详细的介绍。

第二部分介绍限制性作图的3种方法。一种是用多种限制酶消化DNA，通过凝胶电泳分析不同的酶切片段，从而推导出完整的DNA图谱。另一种是部分消化法，即首先以某个酶对DNA进行完全消化，再进行部分消化，部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相应部分的两个以上小片段之和，再根据两类消化中片段大小的关系和交错重叠现象，找出各片段的邻近位置，排出它们的顺序。第三种为末端标记法，对在特定区段频繁出现的限制性位点或小片段进行限制作图。

第三部分讨论除限制酶外其他用于DNA和RNA操作的酶类的性质、主要用途、实验方案及反应条件等。这些酶包括:DNA聚合酶，用来催化以双链DNA或带引物的单链DNA为模板的合成反应;连接酶，用来连接双链DNA片段或单链RNA片段;RNA聚合酶，用来催化以双链DNA为模板的RNA合成;磷酸酯酶，用以除去核酸5'端的磷基;激酶，用以磷酸化5'端的羟基。

第四部分是构建重组DNA分子的一般技术。由于这些技术含有大量的专业技巧，这里仅介绍克隆实验的最佳方案及其基本原理。并对某些特例作了较为详细的讨论，如平端或黏性末端片段的亚克隆、定向克隆、非匹配末端的连接及寡核苷酸接头的连接、PCR技术在DNA重组中的应用等。

第五部分讨论非放射性探针的标记和检测方法。生物素和地高辛标记的探针正广泛用于各种杂交反应中，使用这些探针具有相当的稳定性和敏感性，可用比色法或化学发光系统检测。更重要的是可以免除放射性对人体的损害，因而受到广大科技工作者的欢迎，有取代放射性标记探针之势。

一、限制性内切核酸酶的特性

限制性内切核酸酶的特性主要有以下几点。

(1)各种限制性内切核酸酶具有专一的识别与切割序列(见表1-4)。

(2)识别碱基对数目一般为4bp、5bp、6bp长度范围。但亦有识别序列为8bp或8bp以上者，如NstⅠ和SfiⅠ的识别序列为8bp，可将基因组DNA切割为较大DNA片段，对制作真核基因组物理图谱极为有用。

(3)识别序列大多为二重对称(即回文结构)。

(4)多数限制性内切核酸酶的切割位点就在识别位点内，但少数限制酶的切割位点不在识别位点之内，而是在识别位点的旁侧。例如:HgaⅠ的识别位点是GACGC(5/10)，切割位点在两条DNA链上分别在距识别位点5个和10个核苷酸处。

5'－GACGCNNNNN↓NNNNNN－3'

3'－CTGCGNNNNNNNNNN↑N－5'

表1-4　　　　商品化限制酶的识别序列与反应条件

续表

(5)限制性内切核酸酶对底物的切割有两种方式。有些限制性内切核酸酶在二重对称轴处同时切割DNA的两条链，产生带平端的DNA片段，如PuvⅡ酶切后的DNA为平瑞，而大多数酶则在对称轴处的两侧类似的位置切割产生单链的突出DNA黏性末端。如EcoRⅠ切DNA后产生5'-P端的突出黏性末端，而PstⅠ则产生3'-OH端的突出黏性末端。

(6)有些限制性内切核酸酶虽然来源及识别位点不同，但切割DNA后产生相同匹配的黏性末端，这些酶称为同裂酶。如BamHⅠ识别位点为5'－G↓GATCC－3'，与其相匹配的黏性末端的酶就有BclⅠ、BglⅡ、MobⅠ、XboⅠ。

(7)限制性内切核酸酶一般都以Mg2+为惟一的辅助因子，并要求有一定的盐离子浓度。

(8)限制性内切核酸酶极易失活，要特别注意酶活力的保存，酶保存缓冲液一般为: 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4，缓冲pH)、50～100mmol/L NaCl或KCl(盐离子)、1mmol/L DTT(还原性保持酶活性)、100～200μg/mL BSA(保持蛋白浓度，使酶稳定)、50%甘油(存于－20℃不结冰，结冰反复解冻使酶失活)。()

二、限制性内切核酸酶消化DNA的方法