简述CHO细胞培养基的开发
摘要：细胞培养基在工业用世界杯2022预选赛积分榜 过程中起着至关重要的作用，因为细胞培养基为高密度活细胞的生长和有效治疗性蛋白质的表达提供了必要的营养和适当的环境。细胞培养基除了保证细胞增长和蛋白表达生产率以外，还应考虑其他介质性能方面的问题，例如产品质量和粉末培养基的可制造性。在过去的几十年中，工业细胞培养基已经从包含动物或植物来源成分的制剂演变为化学成分确定的（CD）制剂，以减少引入不确定因子的可能性并减少原材料的变异性。今天我们讨论的重点是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的培养基开发，包括介绍了哺乳动物细胞培养基的简要历史，一般培养基的开发策略和注意事项等等。CHO培养基的历史现今，多种哺乳动物宿主细胞系已用于生产治疗性蛋白质，包括CHO，NS0，BHK，HEK-293和PER-C6。但是，由于CHO具有良好的基因组背景特征，并且在悬浮培养中具有相对较快的生长速度和较高的蛋白质表达产量，因此它被用作生物制品行业的主要生产用细胞系。在1950年代，细胞培养的先驱者开发了培养基的基本配方，例如EMEM和DMEM，它们需要补充血清以支持哺乳动物细胞的生长。科学家汉姆于1965年开发了首个无血清CD培养基F-12，以支持CHO的克隆生长。在其他早期研究中，科学家成功地将胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺和硒用于替代CD培养基中的血清。在新兴技术的推动下，CHO细胞的CD培养基开发在过去的几十年中取得了长足的进步，在某些情况下重组蛋白表达量超过了10g/L。培养基设计策略与现成的选项相比，自定义或高度个性化培养基的关键优势是配方的选择和优化策略，它可以进行有效的过程优化，影响因素的排除，并更好地了解培养基的各个组成部分对产品质量的影响。世界杯2022预选赛积分榜 公司通常的策略是：相同CHO宿主细胞系的早期临床项目开发的平台式流程化开发策略，以便将项目从研究快速转移到临床试验中，也就是说先使用通用型的培养基快速的进行上游细胞筛选、驯化等工作，作为平台过程的一部分，可以使用多种CHO细胞系从通用培养基中开发的培养基进行评估。在研究的后期，可以在以后的阶段针对单个细胞系进行进一步的培养基优化。典型的CHO基础培养基包含50-100种成分，每种物质的浓度都应在其最佳范围内，因为各种物质的不足和缺失或过量都有可能会损害细胞的生长、生产率或产品的质量。细胞培养基是多成分组合的混合物，例如碳水化合物、氨基酸、维生素、微量金属元素、盐、脂质、多胺、保护剂和缓冲液等等。培养基开发工作通常集中在优化碳水化合物、氨基酸、维生素和微量金属元素的浓度上。葡萄糖是用于糖酵解和氧化磷酸化为CHO细胞提供能量的主要碳水化合物。丙酮酸是通过糖酵解在细胞培养过程中产生的，丙酮酸的积累抑制了细胞的生长。所以，科学家开发了通过限制葡萄糖或补充其他碳水化合物来控制乳酸的策略。氨基酸是细胞和治疗性蛋白质的组成部分，优化其浓度一直是培养基开发研究的主要重点。使用代谢通量分析在连续CHO培养中鉴定出四个限制性氨基酸和四个过量氨基酸，调整这八个氨基酸的浓度后，峰值细胞密度和蛋白的表达量分别提高了55％和27％。在另一个示例中，科学家Carrillo Cocom等人，使用HPLC监测补料分批培养中的氨基酸浓度，并确定其耗尽、稳态和积累的氨基酸浓度，为合理的培养基设计提供信息。某些氨基酸（例如天冬酰胺和丝氨酸）在特定的CHO细胞系中起关键作用，所以需要通过代谢谱分析研究阐明它们的代谢。水溶性B族维生素由于其作为酶辅因子的作用而在细胞培养基中必不可少，尽管在培养基中的含量非常少量。我们已经对维生素A、D和E在细胞培养基中的生理功能进行了评估，由于它们在水中的溶解度低，因此很少使用。微量金属元素是无血清培养基中另一个必不可少的营养素，其最佳浓度通常低于细胞生长所需要的维生素浓度。与维生素类似，微量金属元素可作为各种酶的辅助因子，并显着影响细胞的生长、生产力和产品质量。作为氧化磷酸化酶的辅助因子，通常在培养物中添加铜以使乳酸从生产转移到消耗。铁已显示出可增强单克隆抗体（mAb）的产生，但必须适当螯合以防止其以游离形式（在无血清培养基中转铁蛋白结合或在无蛋白质培养基中柠檬酸盐螯合）的毒性作用。除铜和铁外，锌和硒是必不可少的痕量金属元素，据报导它们分别可增强mAb的产生并降低氧化应激反应。除了上面讨论的传统营养成分外，各种生长因子（包括肽，低分子量蛋白质和激素）已被证明可以提高产品的效价。Long®R3IGF-I是胰岛素生长因子-1（IGF-1）类似物，旨在提高稳定性，并已通过增加活细胞密度提高融合蛋白的表达量。包含半胱氨酸和酪氨酸的二肽或三肽已用于改善mAb表达量、产品质量、细胞密度和代谢状况。我们已知17种激素可调节各种细胞活动，据报道，氢化可的松是一种类固醇激素，以剂量和时间依赖性方式延长细胞活力并提高融合蛋白产量。此外，最近的研究已经确定了具有不同作用机理的其他滴度增强剂，包括嘧啶核苷，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和非蛋白氨基酸。但是，在使用生长因子和滴度增强剂时，可能需要考虑以下几个方面：成本，溶解度，稳定性，材料来源，对产品质量属性的影响及其在产品制造过程中的清除率，这些都会影响产品的质量，所以我们应该予以重视。实验方法传统的一次单因素方法仅允许一次更改单个成分的浓度。对于CHO培养基中大量组成成分，此方法就变得非常费力。同样，由于该方法无法研究各个成分之间的相互作用，因此这种实验方法只可能在实验室条件范围内实现局部最优而不是最终的生产全局最优方案。所以，现在我们使用一种称为实验设计（DoE）的统计方法可以同时评估不同组分的浓度和组分之间的相互作用，同时大大减少了实验条件的数量。通常，首先使用筛选设计（例如析因设计，Plackett-Burman设计和确定性筛选设计）来选择具有重大影响或相互作用的培养基组成，例如，使用Plackett-Burman设计在十二种条件下筛选11种成分，生成CD培养基以支持CHO细胞生长。在另一个案例研究中，使用中央复合设计确定了五组组分的最佳浓度，使细胞密度和表达抗体滴度分别提高了35％和50％。多培养基混合也已用于优化培养基配方。这种方法可以同时生成和评估大量培养基配方，预测最佳配方，并确定各个关键成分以供进一步研究。举例来说，通过混合16种CD配方可实现40％的表达量改善，发现有7种成分是增强这总作用的增强剂。
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