基因治疗研究为何选择从 AAV 入手？（答题送礼品

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

自从上世纪八十年代基因治疗出现以来，科研工作者在该领域内已经取得了很大进展，从最初的针对于单基因遗传病，如肺囊性纤维化（cystic pulmonary fibrosis，CPF）和血友病 B 等，发展到眼部疾病、关节炎、肿瘤、肌营养不良症、神经性疾病以及血液性疾病等一系列基因缺陷病[1]。这一过程中 AAV 功不可没。

那么 AAV 究竟有何神奇之处？又对研究起到了哪些助力呢？（为了鼓励大家学习的积极性，识别下发二维码即可参与答题有礼活动，完成 5 个选择题即可领取充电宝、运动水杯等精美礼品。温馨提示：答案均在文内～）

为什么是 AAV（腺相关病毒）？

AAV（腺相关病毒）具有安全性高、免疫原性低、物理性质稳定、感染细胞谱广、体内表达时间长等特点，是目前基因治疗中最常用的载体，AAV 病毒载体构建也是基因治疗关键技术环节。

研究人员针对 AAV 改造进行了一系列研究。通过改造病毒载体的基因结构、扩大其载体容量、提高病毒产率以及对不同组织细胞的转染效率，以使 AAV 载体更加符合不同疾病的需求。但截止目前，AAV 病毒大规模生产的成本平均每人仍高达 50～100 万美元

为什么 AAV 成本这么高？

AAV 载体的纯度要求

AAV 载体空病毒衣壳也会引起免疫反应，并与完整衣壳竞争感染患者细胞，若要达到治疗效果就需要加大注射剂量，会带来高剂量副作用。潜在肝毒性、致癌风险也会相应提高。所以，在 AAV 载体构建后，进行纯度验证是非常重要的环节。

特殊的 ITR 结构突变率高

腺相关病毒（AAV）基因组两端的两个反向末端重复序列（ITR）是 rAAV 包装复制所必需的自身结构。AAV 质粒中的 ITR 区域并不稳定，它的回文序列和高 GC 含量使得它们在细菌繁殖过程中容易突变或丢失。即使最标准的实验方法，制备出来的 AAV 质粒也可能含有 5%～15% 的突变。

AAV 质粒的 ITR 区域表现出高度的不稳定性

（图片来源：金唯智官网）

ITR 缺失对 AAV 病毒的包装和感染力都有明显的影响。筛选两个 ITR 完整的 AAV 载体质粒，并稳定其基因组的结构，对提高病毒生产的产量和增强病毒的感染力都有显著的价值[2]。

ITR 检测难度较大

鉴于 ITR 突变的频率，在病毒包装之前，检测评估质粒中 ITR 区域的完整性就变得至关重要。

但 ITR 区域包含大量回文序列，能形成稳定二级结构。在 sanger 测序中，形成的稳定发夹结构，会抑制 pcr 反应，测序中断，为序列验证带来困难。同样，常规酶切法采用限制性内切酶 SmaI 来验证 ITR 区域的完整性，但当缺失片段很小时，靠着凝胶电泳也是无法区分的。

新型 AAV-ITR 专利测序方法

Azenta Life Sciences 开发了一种原创的 Sanger 测序方案，可以清晰地分析读取 ITR 区域，帮助研发人员有效地评估 ITR 区域的完整性和序列变异度。

常规测序

Azenta AAV-ITR 测序

细菌扩增过程中，AAV 质粒最常见的突变之一是 ITR 的 B-B`或 C-C`臂缺失。这种缺失使得 T 型 ITR 发夹的茎更长，比野生型的 ITR 更加稳定，也更难测通。安升达在对来自不同细菌中扩增的数百条 AAV 质粒进行测序后，我们发现 Azenta 新型 AAV-ITR 测序方法可以稳定测通野生型与缺失突变的 ITR 序列。

采用 Azenta 的 AAV-ITR 测序方案检测 ITR 区域。（A）野生型 AAV2 的 ITR 序列的示意图和色谱图。CC' 臂和 BB' 臂分别用红色和蓝色下划线标出。（B）包含 BB' 臂缺失的突变 AAV2 的 ITR 序列的示意图和色谱图。（C）野生型与 ITR 缺失的突变型混合质粒的色谱图，从 145bp 开始出现套峰。Azenta 的 ITR 测序方法可以检测野生型和突变型 ITR 序列，无显著偏差。