利用游离型表达质粒强化毕赤酵母表达木聚糖酶

作者：张馨予

巴斯德毕赤酵母已成为最广泛的外源蛋白表达系统之一，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到成功表达，重组蛋白产品涉及食品、饲料、医药等众多行业[]。用于食品或者饲料行业的多种酶制剂如植酸酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、α-葡萄糖苷酶等利用毕赤酵母实现了产业化规模的生产[-]。近些年，毕赤酵母被美国FDA认定为Generally recognized as safe (GRAS)微生物[]，使得毕赤酵母在食品领域具备极大的应用潜力。毕赤酵母目前常用的表达质粒根据不同的启动子分为pPIC系列甲醇诱导型表达载体(如pPIC3.5k、pPIC9K、pPICZ、pAO815等)和pGAP系列组成型表达载体。其中pPIC系列质粒含醇氧化酶(AOX)启动子，该启动子是以甲醇为唯一诱导物并受其严谨控制的强启动子，由于AOX表达是受转录水平调控的，其强诱导型启动子AOX能非常有效地控制外源基因的表达[]。但其也有不足之处，毕赤酵母在不受控制的条件下细胞先生长至高密度，然后通过甲醇诱导启动外源蛋白表达，这增加了工程菌的培养时间和工作量。同时在大规模生产过程中，甲醇的使用也存在诸多弊端，如易挥发、浓度不易检测、有潜在的火灾隐患、具有毒性、不适于药品和食品蛋白的生产等[]，因而制约了毕赤酵母表达系统的大规模应用。pGAP系列质粒含3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子，GAP启动子受碳源调控[]，葡萄糖为碳源时其转录水平最高，其次是甘油、油酸，甲醇最低[]。相对于AOX启动子，虽然GAP启动子表达外源蛋白的水平较低，但是该组成型启动子不需甲醇诱导，发酵工艺简单，具有适合于食品规模化应用的优势。因此如果能改造pGAP质粒进而提高异源蛋白的表达水平，将极大促进毕赤酵母在食品领域的应用。

基因拷贝数是毕赤酵母表达重组蛋白的一个影响因素。目前基因拷贝数对表达量的影响仍然无法预测，大多数情况下，外源蛋白的表达量会随着拷贝数的增加而相应增加[]。目前在毕赤酵母系统中多采用在基因组上插入多个外源基因拷贝来增加基因剂量，如通过增加博来霉素浓度来筛选高拷贝外源基因菌株[]，或者应用BglⅡBrick方法将目的基因表达盒用同尾酶连接在一起，构建成含多拷贝表达盒的重组表达质粒并整合到宿主菌株基因组中，从而得到含高拷贝外源基因的转化子[]。过去认为在毕赤酵母中整合到染色体表达比游离载体表达稳定，但研究发现整合区域都是相邻近的位点，稳定性差，在一定条件下可能通过同源重组而丢失[]。此外，在酵母基因组上整合外源基因会对细胞自身生理代谢造成不利影响，整合到基因组中高拷贝重组菌株生长速率和细胞活性都有降低的现象[]。而游离型载体能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增，因而可显著增加外源基因拷贝数，同时游离载体表达方式对菌体基因组影响很小。目前用于毕赤酵母的质粒均为整合型质粒，尚未见到采用游离型表达质粒来进行异源蛋白的表达。

木聚糖酶分布广泛，主要来自自然界中一些真菌、细菌、无脊椎动物体内以及植物组织等[]。人们研究比较多的是微生物生产木聚糖酶，已经报道的产木聚糖酶菌株有各种霉菌和链霉菌以及芽孢杆菌等[-]。木聚糖酶是糖苷水解酶(EC 3.2.1.x)，糖苷水解酶分成若干家族，木聚糖酶主要分布在第10家族(F10)和11家族(G11)两大家族[-]。一般来讲F10木聚糖酶分子质量一般大于30 kDa，结构复杂，含有多个结构域；而G11木聚糖酶多为单一结构域，相对分子质量一般小于30 kDa[-]。木聚糖酶能将木聚糖水解为低聚木糖以及木糖单糖[]，在造纸、面制品、低聚木糖制备、果蔬生产、饲料等行业中有很好的应用价值。目前木聚糖酶异源表达大多以毕赤酵母为宿主并在甲醇诱导下实现，如在本实验室前期研究当中，从链霉菌Streptomyces sp. FA1中分离纯化出一种第10家族(GH10)的木聚糖酶(XynA)，通过构建毕赤酵母重组菌株在甲醇的诱导下实现较高水平分泌表达，摇瓶水平达到130 U/mL[]；张慧敏等将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，转化酵母后用甲醇诱导酶活可达到17.74 U/mL[]。为了消除甲醇在重组木聚糖酶生产中的应用风险，本研究通过选用来源于酵母自身的自我复制序列(PARS)改造pGAP表达质粒，使之成为自主复制的游离型表达载体，不仅可以获得高拷贝数菌株，同时还可以稳定传代。进而比较单独利用游离载体、游离载体与基因整合联用等多种表达组合体来研究进一步提高木聚糖酶的表达水平。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒