一种抗体文库的构建方法及其应用与流程

作者：张馨予

一种抗体文库的构建方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体文库的构建方法及其应用。

背景技术：

抗体是由b细胞表达、结合特定抗原的免疫球蛋白。大多数动物中，抗体由成对的重链和轻链构成。各链由可变区(fv)和恒定区(fc)两种不同的区域组成。其中，重链和轻链的fv区负责与靶抗原的结合，称为抗原结合决定簇。由抗体重链可变区和轻链可变区通过15-20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体称为单链抗体(scfv)。抗体药物在肿瘤，自身免疫病两大领域占主导地位。特别是在肿瘤治疗领域，单克隆抗体以及基于单克隆抗体的抗体药物偶联物、双特异性抗体、嵌合抗原受体t(car-t)细胞等免疫治疗成为目前最热门的肿瘤治疗手段。当前，抗体或抗体片段的各种筛选技术主要是基于b细胞单克隆技术、蛋白展示技术发展而来。

杂交瘤技术是最早用于建立小鼠b细胞单克隆化的技术。将预定抗原免疫后的动物脾细胞与体外培养、可无限生长的骨髓瘤细胞融合，得到b杂交瘤细胞。这种杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养无限增殖，又能像b淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过单克隆化得到单个杂交瘤细胞的细胞系，它所产生的抗体只针对同一抗原表位，这种抗体即所谓单克隆抗体。但由于鼠源抗体对于人来说属于“异种”蛋白，所以当这些单克隆抗体进入人体后，会诱使人体产生针对这些抗体的抗体(即人抗鼠抗体)。人抗鼠抗体会中和鼠源抗体，使得鼠源抗体药物失效。将鼠源抗体的fc段替换为人源抗体的fc段得到人鼠嵌合抗体，进一步将嵌合抗体fv区的fr片段人源化得到人源化抗体，从而降低鼠源单克隆抗的免疫原性。而全人源的单抗更是完全用人类的遗传信息来编码抗体，避免了抗异种蛋白反应。将人b细胞与表达mil-6和htert的鼠骨髓瘤细胞融合而成的人鼠杂交瘤细胞以及用ebv转化人b细胞使其永生化，均是开发全人源单抗的有效手段。

b细胞的单克隆化技术耗时耗力，效率低，无法进行抗体的高通量筛选。蛋白展示技术克服了杂交瘤技术无法进行高通量筛选的缺点，可以从一个巨大的文库中(超过1010个独立克隆)筛选出目的克隆。常用的蛋白展示技术包括噬菌体展示技术、细菌展示技术、核糖体展示技术、酵母展示技术以及哺乳动物细胞展示技术，己经被广泛的应用于新抗体的筛选和抗体亲和力的改进。

噬菌体展示技术由于其相对简单、稳健、方便构建大的人类抗体库等优点，成为迄今为止应用最广泛的展示技术。噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，从而使外源多肽或蛋白与外壳蛋白展示在噬菌体表面。展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构和生物活性，可以识别和结合靶分子。噬菌体展示的肽库或蛋白库与固定后的靶分子结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。将抗体可变区的基因插入噬菌体基因组中，表达的抗体展示到噬菌体的表面，构建噬菌体展示抗体库，可以筛选针对各种抗原的抗体。相对于杂交瘤技术，通过噬菌体展示抗体库技术筛选抗体，可以不经过免疫，缩短抗体生产的周期。也可以筛选在体内免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗体，适用范围广。噬菌体展示抗体库技术不受种属的限制，可以构建各种物种的抗体库。从人天然库中筛选到的抗体，可以不经过人源化过程，直接用于抗体药物研究。噬菌体展示技术以及细菌展示技术受限于展示系统的小容量，更适合展示小肽。因而将其用于抗体文库的展示方面，只能展示抗体的片段，无法进行完整抗体的展示。另外，抗体为真核细胞蛋白，噬菌体和细菌不能保证完全有效地表达真核蛋白。

酵母展示技术已成为筛选人抗体文库以及抗体亲和力成熟的最有力工具之一。最广泛用于酵母展示的系统是酿酒酵母aga1p/2pα-凝集素系统，它依靠二硫键将gpi锚定的aga1p蛋白与展示的抗体连接。与噬菌体展示技术相比，酵母展示技术有许多优点。包括使用多色流式细胞仪来定量酵母表面的抗体表达强度以及与荧光标记的抗原结合强度。酵母可表达分泌型的抗体，有助于筛选更高表达，更好的折叠，和适当分泌的克隆。酵母展示可以容纳所有形式的抗体和抗体片段，包括域抗体(dabs)、scfv、fabs、甚至igg。但是，由于转化效率和流式分析技术的限制，酵母展示的人抗体库容大小是有限的(107-109个独立克隆)。然而，最近改进的酵母电穿孔转化技术已经将转化效率提高到1.5×108个转化子/μgdna，这足以构建多达1010个独立克隆的抗体库。