展示副粘病毒和/或肺炎病毒F蛋白的自组装蛋白纳

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

展示副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的自组装蛋白纳米结构及其用途
技术领域
1.本技术要求于2019年9月4日提交的美国临时专利申请序列号62/895727的优先权，其通过引用整体并入本文。

背景技术：

2.疫苗接种是用于预防或降低各种传染原(包括细菌、病毒和寄生虫)的感染严重程度的一种治疗方式。开发新疫苗具有重要的商业和公共卫生意义。特别地，呼吸道合胞病毒(rsv)的改进疫苗将是所需的。
3.亚单位疫苗是由分离的抗原制成的疫苗，所述分离的抗原通常是在细菌、昆虫或哺乳动物细胞宿主中重组表达的蛋白质。典型地，亚单位疫苗的抗原性组分选自感染性病原体的被观察到在感染后引发天然免疫应答的蛋白质，但是在一些情况下可以使用传染原的其他组分。用于亚单位疫苗的典型抗原包括在目标传染原的表面上表达的蛋白质，诸如病毒的表面表达的包膜糖蛋白。
4.亚单位疫苗具有各种优势，包括它们不含活病原体，从而消除了对疫苗感染患者的担忧；它们可以使用标准的基因工程技术进行设计；它们比其他形式的疫苗更同质；并且它们可以使用充分表征的表达系统在标准化的重组蛋白表达产生系统中生产。在一些情况下，可以对抗原进行基因工程化，以利于生成所需的抗体，诸如中和或广泛中和抗体。具体地，通过x射线晶体学、电子显微镜或核磁共振实验获得的有关目的抗原的结构信息可用于指导亚单位疫苗的合理设计。
5.亚单位疫苗的已知局限性是，所引发的免疫应答有时可能弱于对其他类型的疫苗(诸如全病毒、活疫苗或减毒活疫苗)的免疫应答。本发明人已经认识到，基于纳米结构的疫苗具有利用亚单位疫苗的优点，同时通过以对称有序阵列多价展示抗原来增加疫苗诱导的免疫应答的效力和广度的潜力。

技术实现要素：

6.在一个方面，本公开提供了纳米结构，其包括：
7.(a)多个第一组件，每个第一组件包含多个相同的第一多肽，其中第一多肽包含与选自seq id no:2-4的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的：
8.》i53_dn5a*
9.10.》i53_dn5a.1
[0011][0012]
和
[0013]
》i53_dn5a.2
[0014][0015]
以及
[0016]
(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个相同的第二多肽，其中第二多肽包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的：
[0017][0018]
其中所述多个第一组件与所述多个第二组件非共价相互作用以形成纳米结构；并且
[0019]
其中所述纳米结构在纳米结构的外部展示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的多个拷贝。
[0020]
在一个实施方式中，seq id no:1、2、3和4中粗体且带下划线的残基在第一和第二多肽中是不变的。在另一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含与选自seq id no:21-29和37的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含与包含选自seq id no:21-24和37的氨基酸序列的rsv f蛋白或其突变体具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于参考序列包括以下残基中的一种或多种：67i、149c、458c、46g、465q、215p、92d和487q。在进一步的实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含与包含选自seq id no:25-29的氨基酸序列的hmpv f蛋白或其突变体具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽相对于参考序列包括以下残基中的一种或多种：113c、120c、339c、160f、177l、185p和426c。
[0021]
在一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段被表达为与第一多肽和/或第二多肽的融合蛋白。在另一个实施方式中，所述多个第一组件各自包含相同的融合蛋白和/或其中所述多个第二组件各自包含相同的融合蛋白。在另一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段被表达为
与第一多肽的融合蛋白。在一个实施方式中，所述多个第一组件各自包含相同的融合蛋白。在另一个实施方式中，所述多个第一和/或第二组件总共包含两种或更多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段，其表达为与第一多肽和/或第二多肽的融合蛋白。在一个实施方式中，仅第一多肽和/或第二多肽的子集包含具有f蛋白或其抗原性片段的融合蛋白。
[0022]
在另一个实施方式中，每个第一组件包含第一多肽的同源三聚体。在进一步的实施方式中，每个第二组件包含第二多肽的同源五聚体。
[0023]
在一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含与ds-cav1(seq id no:37)的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方式中，每个融合蛋白包含位于第一多肽和所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段之间的氨基酸接头，和/或位于第二多肽和所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段之间的氨基酸接头。在一个实施方式中，氨基酸接头序列包含一个或多个三聚化结构域。在其他实施方式中，氨基酸接头序列包含氨基酸序列gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl(seq id no:38)、gcn4卷曲螺旋结构域，包括但不限于氨基酸序列iedkieeilskiyhieneiarikkli(seq id no:19)，或gly-ser接头或选自a,agga(seq id no:33)、aggam(seq id no:34)、ggs、gsg和sgg的接头。
[0024]
在一个实施方式中，融合蛋白包含与选自seq id no:5-11的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0025]
在另一个实施方式中，该纳米结构：
[0026]
(a)结合融合前f特异性抗体，包括但不限于单克隆抗体d25；
[0027]
(b)形成对称结构，包括但不限于二十面体结构；
[0028]
(c)在50℃下稳定；和/或
[0029]
(d)在2.25m盐酸胍中稳定。
[0030]
本公开还提供了编码本文任何实施方式的融合体的核酸、包含本公开核酸的表达载体，以及包含本公开核酸或表达载体的宿主细胞。本公开还提供了包含本文实施方式的纳米结构和药学上可接受的载体的免疫原性组合物。在一个实施方式中，免疫原性组合物进一步包含佐剂。
[0031]
本公开进一步提供了用于在受试者中产生针对副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的免疫应答的方法，以及治疗或限制受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒感染的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的本文任何实施方式的纳米结构或免疫原性组合物，以在受试者中产生免疫应答，或者治疗或预防副粘病毒和/或肺炎病毒感染。
[0032]
本文还提供了用于体外组装本文任何实施方式的纳米结构的方法，其包括在水性条件下混合两种或更多种纳米结构组分，以驱动所需纳米结构的自发组装。
附图说明
[0033]
图1示出了本公开的rsv纳米结构疫苗的说明性实施方式的示意图。rsv的f蛋白(倾斜图案)融合至i53_dn5b纳米结构组分(水平图案)。在一些实施方式中，在f蛋白和i53_
dn5b(纯黑色)之间包括介于中间的折叠子三聚化结构域。不同长度的接头包含在这些结构域(线)之间。未示出可裂解的n-末端分泌信号和可裂解的c-末端纯化标签。
[0034]
图2示出了通过酶联免疫吸收测定(elisa)测定的说明性构建体rsv_f-dn5b_04至rsv_f-dn5b_07的表达水平的图。
[0035]
图3示出了使用以下对rsv f蛋白表位特异的抗体在系统上构建rsv_f-dn5b_07(387)的生物层干涉测量图：pali，rsv f蛋白特异性抗体(融合前和融合后)；am14，融合前三聚体构象特异性抗体；4d7，融合后构象特异性抗体。
[0036]
图4a示出了在使用在融合前构象d25中的rsv f蛋白特异的抗体的系统上，rsv_f-dn5b_07(387)与rsv_f-50a(309)相比的生物层干涉测量图。
[0037]
图4b示出了每个构建体的反应性分数的柱状图，其来源于图4b所示的数据。
[0038]
图5示出了描绘对组装成具有伴随组分i53_dn5a的纳米结构的rsv_f-dn5b_07进行的动态光散射测量的图。示出了三次实验的数据。纳米结构的流体动力学半径(rh)为23nm，且多分散性(pd)为17％。
[0039]
本公开的选定序列
[0040]
seq id no:1
ꢀꢀꢀꢀꢀ
i53_dn5b
[0041]
seq id no:2
ꢀꢀꢀꢀꢀ
i53_dn5a
[0042]
seq id no:3
ꢀꢀꢀꢀꢀ
i53_dn5a.1
[0043]
seq id no:4
ꢀꢀꢀꢀꢀ
i53_dn5a.2
[0044]
seq id no:5
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_01
[0045]
seq id no:6
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_02
[0046]
seq id no:7
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_03
[0047]
seq id no:8
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_04
[0048]
seq id no:9
ꢀꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_05
[0049]
seq id no:10
ꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_06
[0050]
seq id no:11
ꢀꢀꢀꢀ
rsv_f-dn5b_07
[0051]
seq id no:37
ꢀꢀꢀꢀ
ds-cav1
[0052]
seq id no:38
ꢀꢀꢀꢀ
折叠子三聚化标签
具体实施方式
[0053]
引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。在本技术中，除非另有说明，否则所利用的技术可以在诸如以下的若干篇熟知的参考文献中找到：molecular cloning:a laboratory manual(sambrook等人,1989,cold spring harbor laboratory press)；gene expression technology(methods in enzymology,第185卷,由d.goeddel编辑,1991.academic press,san diego,ca)；“guide to protein purification”in methods in enzymology(m.p.deutshcer编辑,(1990)academic press,inc.)；pcr protocols:a guide to methods and applications(innis等人1990.academic press,san diego,ca)；culture of animal cells:a manual of basic technique,第2版(r.i.freshney.1987.liss,inc.new york,ny)；gene transfer and expression protocols,第109-128页,e.j.murray编辑,the humana press inc.,clifton,n.j.)；以及
ambion 1998catalog(ambion,austin,tx)。
[0054]
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。
[0055]
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(ala；a)、天冬酰胺(asn；n)、天冬氨酸(asp；d)、精氨酸(arg；r)、半胱氨酸(cys；c)；谷氨酸(glu；e)、谷氨酰胺(gln；q)、甘氨酸(gly；g)；组氨酸(his；h)、异亮氨酸(ile；i)、亮氨酸(leu；l)、赖氨酸(lys；k)、蛋氨酸(met；m)、苯丙氨酸(phe；f)、脯氨酸(pro；p)、丝氨酸(ser；s)、苏氨酸(thr；t)、色氨酸(trp；w)、酪氨酸(tyr；y)和缬氨酸(val；v)。
[0056]
如本文所使用，“约”意指所叙述的参数的+/-5％。
[0057]
除非上下文另有明确规定，否则本公开任何方面的所有实施方式均可以组合使用。
[0058]
除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包括”、“包含”等应在包括性的意义上解释，而不是在排他性或穷举的意义上；也就是说，在“包括但不限于”的意义上解释。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，词语“本文”、“以上”和“以下”和类似含义的词语在本技术中使用时应是指整个本技术而非本技术的任何特定部分。
[0059]
本公开的实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。虽然本文出于说明性目的描述了本公开的具体实施方式和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等同性修改。
[0060]
在第一方面，本公开提供了纳米结构，其包括：
[0061]
(a)多个第一组件，每个第一组件包含多个相同的第一多肽，其中第一多肽包含与选自seq id no:2-4的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的：
[0062]
》i53_dn5a*
[0063][0064]
》i53_dn5a.1
[0065][0066]
和
[0067]
》i53_dn5a.2
[0068]
[0069]
和
[0070]
(b)多个第二组件，每个第二组件包含多个相同的第二多肽，其中第二多肽包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中括号中的残基是任选的：
[0071]
i53_dn5b*
[0072][0073]
其中所述多个第一组件与所述多个第二组件非共价相互作用以形成纳米结构；并且
[0074]
其中所述纳米结构在纳米结构的外部展示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的多个拷贝。
[0075]
本文公开了自组装多肽纳米结构，其在纳米结构外部多价展示副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白。第一和第二多肽对的多个拷贝能够自组装以形成纳米结构，诸如二十面体纳米结构。纳米结构包括对称重复的非天然、非共价多肽-多肽界面，所述界面使第一组件和第二组件取向为纳米结构，诸如具有二十面体对称性的纳米结构。
[0076]
本公开的纳米结构是合成的，因为它们不是天然存在的。第一多肽和第二多肽是非天然存在的蛋白质，可以通过任何合适的方法产生，包括重组生产或化学合成。所述多个第一多肽的每个成员彼此相同，并且所述多个第二多肽的每个成员彼此相同(尽管当第一或第二多肽作为与一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的融合多肽存在时，f蛋白或其抗原性片段可能与第一或第二多肽彼此不同)。第一蛋白质和第二蛋白质是不同的。
[0077]
多个(2、3、4、5、6或更多个)第一多肽自组装以形成第一组件，并且多个(2、3、4、5、6或更多个)第二多肽自组装以形成第二组件。然后多个这些第一和第二组件经由设计的界面非共价地自组装以产生纳米结构。
[0078]
第一组件中第一多肽的数量可以与第二组件中第二多肽的数量相同或不同。在一个示例性实施方式中，第一组件包含第一多肽的三聚体，并且第二组件包含第二多肽的五聚体。
[0079]
对于所得纳米结构的给定目的，第一和第二多肽可以是任何合适的长度。
[0080]
seq id no:1和2-4的分离多肽具有成对自组装以形成纳米结构(诸如二十面体纳米结构)的能力。此类对的设计涉及对针对可以组装以形成纳米结构的多肽对的每个成员的合适界面残基的设计。如此形成的纳米结构包括对称重复的非天然、非共价多肽-多肽界面，所述界面使第一组件和第二组件取向为纳米结构，诸如具有二十面体对称性的纳米结构。
[0081]
通常，与蛋白质一样，预期多肽耐受设计序列中的一些变异而不破坏随后向纳米结构的组装：特别是当这种变异包含保守氨基酸取代时。如在此所用，“保守氨基酸取代”意指：疏水性氨基酸(ala、cys、gly、pro、met、see、sme、val、ile、leu)只能被其他疏水性氨基
酸取代；具有大体积侧链的疏水性氨基酸(phe、tyr、trp)只能被具有大体积侧链的疏水氨基酸取代；具有带正电荷侧链的氨基酸(arg、his、lys)只能被具有带正电荷侧链的其他氨基酸取代；具有带负电荷侧链的氨基酸(asp、glu)只能被具有带负电荷侧链的其他氨基酸取代；并且具有极性不带电荷侧链的氨基酸(ser、thr、asn、gln)只能被具有极性不带电荷侧链的其他氨基酸取代。
[0082]
在一个实施方式中，seq id no:1-4中粗体且带下划线字体的所有寡聚化位置在第一多肽和第二多肽中是不变的。
[0083]
在一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段被表达为与第一和/或第二多肽的融合蛋白。在这些实施方式中，优选的是所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段在融合蛋白的n末端处存在，只要该构型可以有利于所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段在纳米结构的外部的呈现。对于在融合蛋白n末端处存在副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的这种偏好来源于副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的c末端在f蛋白三聚体的一个末端(“底部”)处的位置；通过将基因融合体定位在这一点上，大部分f蛋白结构将在纳米结构外部展示并可触及。在进一步的实施方式中，纳米结构包括融合蛋白的一个或多个拷贝，所述融合蛋白包含至少两个结构域：副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段，和三聚体组件结构域(即：每个第一组件均是第一多肽的同源三聚体)；以及第二寡聚体嵌段的一个或多个拷贝(即，每个第二组件是第二多肽的两个或更多个拷贝的寡聚体)。在另一个实施方式中，第一和/或第二多肽可以被修饰以允许所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段共价连接至第一和/或第二多肽。在一个非限制性实例中，第一和/或第二多肽可以被修饰，诸如通过在限定的位置处引入各种半胱氨酸残基，以有利于连接一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段。
[0084]
在其他实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段经由任何合适的技术附着于第一或第二多肽，所述技术包括但不限于共价化学交联(经由任何合适的交联技术)和包括工程静电相互作用的非共价附着。
[0085]
三聚体组件结构域
[0086]
在包含三聚体副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的三聚体组件的一个实施方式中，副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段与自组装成三聚体组件的第一多肽遗传融合。三聚体组件包含蛋白质-蛋白质界面，所述界面诱导第一多肽的三个拷贝自我缔合以形成三聚体构建块。第一多肽的每个拷贝进一步包含与第二组件结构域上的互补表面暴露界面相互作用的表面暴露界面。三聚体组件结构域和第二组件结构域之间的互补蛋白质-蛋白质界面驱动三聚体组件结构域和第二组件结构域的多个拷贝组装成目标纳米结构。在一些实施方式中，纳米结构的三聚体组件结构域的每个拷贝均作为基因融合体带有副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段；这些纳米结构以全价态展示f蛋白。在其他实施方式中，本公开的纳米结构包括作为基因融合体带有副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的三聚体组件结构域的一个或多个拷贝，以及未作为基因融合体带有f蛋白的一个或多个三聚体组件结构域；这些纳米结构以部分价态展示f蛋白。三聚体组件结构域可以是形成三聚体并与第二组件结构域相互作用以驱动组装成目标纳米结构的任何多肽序列。
[0087]
本公开的纳米结构在纳米结构的外部展示一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的多个拷贝(即：2、3或更多个)。示例性副粘病毒和/或肺炎病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(rsv)和人偏肺病毒(hmpv)。(c.l.afonso等人,taxonomy of the order mononegavirales:update 2016.arch.virol.161,2351-2360(2016))。
[0088]
如本文所用，“在纳米结构的外部”意指所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段的抗原性部分可被b细胞受体、抗体或抗体片段结合，而不被包埋在纳米结构内。
[0089]
所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段可以包含任何合适的天然f蛋白、融合后或融合前(pref)抗原或其能够诱导免疫应答的突变体，所述免疫应答将产生与副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白结合的抗体。纳米结构可以展示多于一种f蛋白；因此，在一些实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含1、2、3、4或更多种f蛋白或其抗原性片段。在一个实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段可以如专利公开号us 2016/0046675 a1中所定义。在一些实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段选自如美国公开专利申请2016/0046675中所公开的seq id no:1-350、370-382、389-693、698-1026、1429-1442、1456-1468和1474-1478。在其他实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段可以如wo2012158613、us 20160102123、us20140141037、wo2014079842、wo2014160463、us20140271699、ep2970393、wo2014174018、us20140271699、us20160176932、us20160122398、wo2017040387、wo2017109629、wo2017172890、wo2017207477、krarup等人(2015)nature communications6:8143和wo2017207480中所定义。
[0090]
在具体实施方式中，所述一种或多种副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白或其抗原性片段包含与下面所示的ds-cav1的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列(在每种情况下，所述蛋白质均可以用合适的分泌信号(在一些情况下，是可裂解的分泌信号，例如mellilkanaittiltavtfcfasg(seq id no:20))n-末端表达至本文公开的序列)。ds-cav1包含融合前稳定形式的融合(f)糖蛋白，与融合后rsv f相比，其在小鼠和猕猴中引发针对呼吸道合胞病毒(rsv)的改善的保护性反应(mclellan等人(2013)science 342:592-8)。ds-cav1(seq id no:37)(括号中的残基是任选的)：
[0091][0092]
在其他实施方式中，f蛋白可以包含与选自seq id no:21-22的氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0093]
rsv f
[0094]
sc9-10 ds-cav1 a149c y458c(seq id no:21)
[0095][0096][0097]
sc9-10 ds-cav1 a149c y458c s46g k465q s215p e92d(seq id no:22)
[0098][0099]
seq id no:21-22代表第二代稳定的ds-cav1免疫原；注意到相对于ds-cav1的突变，并且应当注意的是，本公开考虑了使用ds-cav1突变体，其区别在于上述seq id no:21或22中的单个所述氨基酸取代，或者两个或更多个所述氨基酸取代。在其他实施方式中，f蛋白可以包含以下中的一种或多种，每种可以另外地包含1、2或更多个上述seq id no:21
或22中所述的氨基酸取代：
[0100]
rsvf sc-dm(n67i、s215p)(seq id no:23)
[0101][0102]
sc-tm(n67i、s215p和e487q)(seq id no:24)
[0103][0104]
hmpv f蛋白，菌株can97-83(a2)(seq id no:25)
[0105][0106]
具有a113c、a339c、t160f、i177l的hmpvf(seq id no:26)
[0107][0108]
具有a113c、a120c、a339c、t160f、i177l和q426c的hmpv f(seq id no:27)
[0109][0110][0111]
hmpv f aak62968.2融合蛋白[人偏肺病毒](seq id no:28)
[0112][0113]
115-bv(a185p)(seq id no:29)
no:31)、gsggsgsg(seq id no:32)、agga(seq id no:33)、g,aggam(seq id no:34)、gs或gsgs(seq id no:35)。
[0124]
因此，在各种非限制性实施方式中，其中f蛋白作为与第一多肽的融合蛋白存在并且使用接头，f蛋白-接头序列可以包含以下(在这些非限制性实施方式中，以ds-cav1作为f蛋白的例子)。括号中的残基是任选的。所述蛋白质可以任选地用氨基酸序列mellilkanaittiltavtfcfasg(seq id no:20)表达为n-末端ds-cav1信号肽，在加工过程中被切割(未示出)：
[0125]
ds-cav1-折叠子(seq id no:36)：
[0126][0127]
在各种进一步的实施方式中，第一多肽包含与f蛋白融合的第一多肽的融合多肽或由其组成，其中融合蛋白包含与选自seq id no:5-11(括号中任选的残基)的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0128]
斜体：ds-cav1
[0129]
括号中的残基是任选的
[0130]
带下划线：t4 fibritin折叠子结构域
[0131]
粗字体：i53_dn5b*
[0132]
rsv_f-dn5b_01(seq id no:5)
[0133][0134]
rsv_f-dn5b_02(seq id no:6)
[0135][0136]
rsv_f-dn5b_03(seq id no:7)
[0137][0138][0139]
rsv_f-dn5b_04(seq id no:8)
[0140][0141]
rsv_f-dn5b_05(seq id no:9)
[0142][0143]
rsv_f-dn5b_06(seq id no:10)
[0144][0145]
rsv_f-dn5b_07(387)(seq id no:11)
[0146]
[0147]
第二组件
[0148]
本公开的纳米结构可以包含三聚体第一组件的多个拷贝和第二组件的多个拷贝。第二组件包含蛋白质-蛋白质界面，所述界面诱导第二多肽的多个拷贝自我缔合以形成第二组件。第二组件的多种寡聚状态可以与纳米结构形成相容，包括二聚(两个拷贝)、三聚(三个拷贝)、四聚(四个拷贝)、五聚(五个拷贝)、六聚(六个拷贝)或更高的寡聚状态。第二组件的每个拷贝进一步包含与三聚体组件结构域上的互补表面暴露界面相互作用的表面暴露界面。三聚体组件结构域和第二组件结构域之间的互补界面驱动三聚体组件结构域和第二组件结构域的多个拷贝组装成目标纳米结构。
[0149]
通过体外组装两种组分来组装全价态纳米结构
[0150]
在一些实施方式中，纳米结构的每个三聚体第一组件作为基因融合体带有相同的f蛋白；这些纳米结构以全(100％)价态展示f蛋白。此类纳米结构由纯化的第一多肽和第二多肽在称为体外组装的过程中产生。在水性条件下，将包含f蛋白的纯化的三聚体第一多肽与合适的第二多肽以大约1:1的摩尔比混合。第二组件与三聚体第一组件相互作用，以便驱动目标纳米结构的组装。目标纳米结构的成功组装可以通过以下方式进行确认：通过用于评估蛋白质或蛋白质组装体的物理尺寸的常用生物化学或生物物理方法分析体外组装反应，所述方法包括但不限于尺寸排阻色谱法、天然(非变性)凝胶电泳、动态光散射、多角度光散射、分析型超速离心、负染色电子显微镜、低温电子显微镜或x射线晶体学。如有必要，可以使用通常用于根据蛋白质物理尺寸分离蛋白质的制备技术，从体外组装反应中存在的其他物质或分子中纯化组装的纳米结构，所述制备技术包括但不限于尺寸排阻色谱法、制备型超速离心、切向流过滤、或制备型凝胶电泳。可以通过通常用于确定水溶液中蛋白质分子的身份的技术来评估纳米结构中f蛋白的存在，包括但不限于sds-page，质谱，蛋白质测序或氨基酸分析。可以通过通常用于检测抗原的存在和构象的技术来评估蛋白质在颗粒外部的可及性，以及其构象或抗原性，所述技术包括但不限于通过单克隆抗体、构象特异性单克隆抗体或对抗原具有特异性的抗血清进行的结合。
[0151]
部分价态纳米结构的体外组装
[0152]
在其他实施方式中，本公开的纳米结构包括作为基因融合体带有f蛋白的三聚体第一组件的一个或多个拷贝，以及未作为基因融合体带有f蛋白的一个或多个三聚体第一组件；这些纳米结构以部分价态展示f蛋白。这些部分价态纳米结构是通过用第一多肽的混合物进行体外组装而产生的，其中作为基因融合体带有f蛋白的三聚体第一组件的分数等于所得纳米结构中抗原的所需价态。体外组装反应通常包含大约1:1摩尔比的总第一多肽与总第二多肽。作为非限制性实例，用三聚体组件的混合物(其中一半的第一多肽作为基因融合体带有f蛋白)进行体外组装反应将产生f蛋白价态为50％的组装纳米结构。也就是说，纳米结构上f蛋白展示的50％的可能位点将被占据。作为非限制性实例，如果纳米结构是具有二十面体对称性的120亚单位组件，则纳米结构包含总共20个三聚体构建块，并且50％价态纳米结构展示10个可能的20个f蛋白三聚体。以这种方式，在体外组装反应中，带有f蛋白的第一多肽与缺乏f蛋白的第一多肽的比率可以用于精确调整所得纳米结构的f蛋白价态。本领域技术人员将理解，可以这种方式调整的是平均价态；混合物中单个纳米结构的价态将以平均值为中心分布。可以使用上述用于评估全价态纳米结构的技术来评估这种部分价态纳米结构的成功组装，并且如果需要，可以使用所述用于纯化全价态纳米结构的方法来
纯化部分价态纳米结构。给定样品中带有f蛋白的第一多肽的平均价态可以通过使用上文关于评价全价态纳米结构中f蛋白的存在所述的技术进行定量分析来评估。
[0153]
共展示多种f蛋白的纳米结构的体外组装
[0154]
在其他实施方式中，本公开的纳米结构包括两种或更多种不同的作为基因融合体带有不同f蛋白的第一多肽；这些纳米结构在同一纳米结构上共同展示多种不同的f蛋白。通过以下方式来产生这些多抗原纳米结构：与第一多肽的混合物进行体外组装，其中每种第一多肽作为基因融合体带有两种或更多种不同f蛋白中的一种。混合物中每种第一多肽的分数决定了所得纳米结构中每种f蛋白的平均价态。体外组装反应通常包含大约1:1摩尔比的总三聚体第一多肽与总第二多肽。给定样品中每种带有f蛋白的第一多肽的存在和平均价态可以通过使用上文关于评价全价态纳米结构中f蛋白的存在所述的技术进行定量分析来评估。
[0155]
在各种实施方式中，纳米结构的直径在约20纳米(nm)至约40nm之间，其中内部腔跨度在约15nm至约32nm之间，并且蛋白质壳中的孔径的最长尺寸在约1nm至约14nm之间。
[0156]
在一个实施方式中，纳米结构具有二十面体对称性。在该实施方式中，纳米结构可以包括第一多肽的60个拷贝和第二多肽的60个拷贝。在一个这种实施方式中，每个第一组件中相同的第一多肽的数目不同于每个第二组件中相同的第二多肽的数目。例如，在一个实施方式中，纳米结构包括十二个第一组件和二十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包括相同的第一多肽的五个拷贝，并且每个第二组件可以例如包括相同的第二多肽的三个拷贝。在另一个实施方式中，纳米结构包括十二个第一组件和三十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包括相同的第一多肽的五个拷贝，并且每个第二组件可以例如包括相同的第二多肽的两个拷贝。在进一步的实施方式中，纳米结构包括二十个第一组件和三十个第二组件；在该实施方式中，每个第一组件可以例如包括相同的第一多肽的三个拷贝，并且每个第二组件可以例如包括相同的第二多肽的两个拷贝。所有这些实施方式均能够形成具有规则二十面体对称性的合成纳米材料。
[0157]
在另一个实施方式中，本公开的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构具有一种或多种以下特征，每种特征如以下实施例中所示：
[0158]
(a)结合融合前f特异性抗体，包括但不限于单克隆抗体d25；
[0159]
(b)形成对称结构，包括但不限于二十面体结构；
[0160]
(c)在50℃下稳定；和/或
[0161]
(d)在2.25m盐酸胍中稳定。
[0162]
在另一个方面，本公开提供了编码本公开的融合蛋白的核酸。所述核酸序列可以包含rna或dna。此类核酸序列可以包含用于促进编码的蛋白的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polya序列、修饰的kozak序列以及编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，对于本领域技术人员而言清楚的是，何种核酸序列将编码本公开的蛋白质。
[0163]
在另一方面，本公开提供了表达载体，其包含可操作地连接至合适的控制序列的本公开的任何实施方式或实施方式组合的分离的核酸。表达载体包括将核酸编码区域或基因可操作地连接至能够实现基因产物表达的任何控制序列的载体。可操作地连接至本公开的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子的表达的核酸序列。控制序列不必与核酸序
列邻接，只要所述控制序列起作用以引导所述核酸序列的表达即可。因此，例如，在启动子序列与核酸序列之间可以存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”至所述编码序列。其他此类控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。此类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任一种驱动，所述启动子包括但不限于cmv、sv40、rsv、肌动蛋白、ef)或诱导型的(由许多诱导型启动子中的任一种驱动，所述诱导型启动子包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇响应性)。用于转染原核细胞的表达载体的构建也是本领域熟知的，因此可以经由标准技术来完成。(参见例如sambrook,fritsch和maniatis,于：molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,1989；gene transfer and expression protocols,第109-128页,e.j.murray编辑,the humana press inc.,clifton,n.j.)；和the ambion 1998catalog(ambion,austin,tx)。表达载体必须可作为附加体或通过整合到宿主染色体dna中在宿主生物体中复制。在一个优选的实施方式中，表达载体包括质粒。然而，本公开旨在包括起着等效功能的其他表达载体，诸如病毒载体。
[0164]
在另一个方面，本公开提供了已经用本文公开的核酸或表达载体转染的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是原核的或真核的，诸如哺乳动物细胞。细胞可以是瞬时或稳定转染的。可以经由本领域已知的任何技术来实现表达载体向原核和真核细胞中的这种转染，所述任何技术包括但不限于标准细菌转化，磷酸钙共沉淀，电穿孔或脂质体介导、deae葡聚糖介导、聚阳离子介导或病毒介导的转染。(参见例如molecular cloning:a laboratory manual(sambrook,等人,1989,cold spring harbor laboratory press；culture of animal cells:a manual of basic technique,第2版(r.i.freshney.1987.liss,inc.new york,ny)。产生根据本公开的多肽的方法是本公开的另外部分。所述方法包括以下步骤：(a)在有利于多肽表达的条件下培养根据本公开的宿主，和(b)任选地，回收表达的多肽。
[0165]
在另一方面，本公开提供了一种免疫原性组合物，其包含有效量的本公开的任何实施方式或实施方式组合的纳米结构和药学上可接受的载体。所述组合物可以包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。
[0166]
在一些实施方式中，药物组合物中的缓冲液是tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。组合物还可以包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施方式中，组合物包含防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸及其各种混合物。在其他实施方式中，组合物包含增量剂，如甘氨酸。在又其他实施方式中，组合物包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨糖醇三月桂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯或其组合。组合物还可以包含张力调节剂，例如使配制品与人血基本等渗或等渗的化合物。示例性张力调节
剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露糖醇、右旋糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施方式中，组合物另外包含稳定剂，例如以冻干或液体形式基本上防止或减少纳米结构的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。
[0167]
纳米结构可以是组合物中唯一的活性剂，或者组合物可以进一步包含一种或多种适用于预期用途的其他试剂，包括但不限于通常刺激免疫系统和改善整体免疫应答的佐剂。可以使用任何合适的佐剂。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。示例性佐剂包括但不限于adju-phos
tm
、adjumer
tm
、白蛋白-肝素微粒、海藻葡聚糖、阿尔加穆林(algammulin)、明矾、抗原配制品、as-2佐剂、自体树突状细胞、自体pbmc、avridine
tm
、b7-2、bak、bay r1005、布比卡因、盐酸布比卡因、bwzl、骨化三醇、磷酸钙凝胶、ccr5肽、cfa、霍乱全毒素(ct)和霍乱毒素b亚基(ctb)、霍乱毒素a1-亚基-蛋白ad片段融合蛋白、cpg、crl1005、含细胞因子的脂质体、d-murapalmitine、dda、dhea、白喉类毒素、dl-pgl、dmpc、dmpg、doc/明矾复合物、禽痘、弗氏(freund's)完全佐剂、γ菊粉、gerbu佐剂、gm-csf、gmdp、hgm-csf、hil-12(n222l)、htnf-α、ifa、pcdna3中的ifn-γ、il-12dna、il-12质粒、il-12/gmcsf质粒(sykes)、pcdna3中的il-2、il-2/ig质粒、il-2/ig蛋白、il-4、pcdna3中的il-4、imiquimod
tm
、immther
tm
、含针对共刺激分子的抗体的免疫脂质体、干扰素-γ、白介素-1β、白介素-12、白介素-2、白介素-7、iscom(s)
tm
、iscoprep 7.0.3
tm
、钥孔戚血蓝素、基于脂质的佐剂、脂质体、洛索立宾(loxoribine)、lt(r192g)、lt-oa或lt口服佐剂、lt-r192g、ltk63、ltk72、mf59、montanide isa51、montanide isa720、mpl.tm.、mpl-se、mtp-pe、mtp-pe脂质体、murametide、murapalmitine、nago、nct天然霍乱毒素、非离子型表面活性剂囊泡、霍乱毒素mct-e112k的无毒突变体e112k、对羟基苯甲酸甲酯、pcil-10、pcil12、pcmvmcat1、pcmvn、peptomer-np、pleuran、plg、plga、pga和pla、pluronic l121、pmma、podds
tm
、聚ra:聚ru、聚山梨醇酯80、螺旋蛋白(protein cochleates)、qs-21、quadri a皂苷、quil-a、rehydragel hpa、rehydragel lv、ribi、ribilike佐剂系统(mpl、tmd、cws)、s-28463、saf-1、sclavo肽、sendai脂蛋白体、含有sendai的脂质基质、span 85、specol、角鲨烷1、角鲨烯2、硬脂酰酪氨酸、破伤风类毒素(tt)、theramide
tm
、苏氨酰基胞壁酰二肽(tmdp)、ty颗粒和walter reed脂质体。佐剂的选择取决于待治疗的受试者。优选地，使用药学上可接受的佐剂。
[0168]
在另一个方面，本公开提供了用于在受试者中产生针对副粘病毒和/或肺炎病毒f蛋白的免疫应答的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的任何实施方式或实施方式组合的免疫原性组合物以产生免疫应答。在另一方面，本公开提供了用于治疗或预防受试者中的副粘病毒和/或肺炎病毒感染的方法，其包括向受试者施用有效量的本公开的任何实施方式或实施方式组合的免疫原性组合物，从而治疗或预防受试者中的副粘病毒和/或肺炎病毒感染。
[0169]
在一个实施方式中，副粘病毒和/或肺炎病毒包括呼吸道合胞病毒。“呼吸道合胞病毒”和“rsv”是指引起呼吸道疾病的负义单链rna病毒，特别是在儿童中。当所述方法包括治疗rsv感染时，将所述免疫原性组合物施用至已经被rsv感染的受试者，和/或患有表明受试者可能已经被rsv感染的症状(包括但不限于下呼吸道感染、上呼吸道感染、细支气管炎、肺炎、发烧、精神萎靡、食欲减退、反复发作的喘息和哮喘)的受试者。如本文所用，“治疗”或“治愈”包括但不限于完成以下一项或多项：(a)降低受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒的滴度；(b)限制受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒滴度的任何增加；(c)降低副粘病毒和/或肺炎病毒症状的严重性；(d)限制或预防感染后副粘病毒和/或肺炎病毒症状的发展；(e)抑制副粘病毒和/或肺炎病毒症状的恶化；(f)限制或预防先前有副粘病毒和/或肺炎病毒感染症状的受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒症状的复发；和/或促进副粘病毒和/或肺炎病毒抗体母体传播至婴儿(在母体免疫后)。
[0170]
当所述方法包括限制副粘病毒和/或肺炎病毒感染时，将免疫原性组合物预防性地施用至未知被感染，但可能处于暴露于副粘病毒和/或肺炎病毒风险中的受试者。如本文所用，“限制”意指在处于rsv感染风险中的受试者中限制rsv感染。处于特别高风险中的群组包括18岁以下的儿童(特别是3岁或更小的婴儿)、65岁以上的成人，以及患有任何类型免疫缺陷的个体。
[0171]
如本文所用,“有效量”是指有效治疗和/或限制rsv感染的免疫原性组合物的量。免疫原性组合物通常被配制成药物组合物，诸如以上公开的那些，并且可以经由任何合适的途径施用，包括口服、肠胃外、通过吸入喷雾、直肠或者以含有常规药学上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂局部施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、颅内、胸内、输注技术或腹膜内。多肽组合物也可以经由微球、脂质体、免疫刺激复合物(iscom)或其他微粒递送系统或引入合适组织(诸如血液)的持续释放制剂来施用。可以调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如，治疗或预防反应)。合适的剂量范围可以是，例如，0.1ug/kg-100mg/kg体重的f蛋白或其抗原性片段。组合物可以在单次推注中递送，或者可以如由主治医务人员所确定多于一次(例如，2、3、4、5或更多次)进行施用。
[0172]
在一个实施方式中，所述施用导致受试者中副粘病毒和/或肺炎病毒中和抗体的产生。在另一个实施方式中，中和抗体以至少1000的滴度(1/id
50
)存在于受试者的血清中；在其他实施方式中，中和抗体以2000或5000的滴度存在于受试者的血清中。
[0173]
实施例
[0174]
ds-cav1-i53_dn5b融合蛋白的表达和纯化
[0175]
测试了图1所示的每种构建体设计(对应于seq id no:5-11)的表达。所述构建体包括n-末端分泌信号(seq id no:20)和c-末端纯化标签，所述标签包括tev切割位点、myc标签和his标签。包括这些标签的完整结构如下：
[0176]
rsv_f-dn5b_01(seq id no:12)
[0177][0178]
rsv_f-dn5b_02(seq id no:13)
[0179][0180]
rsv_f-dn5b_03(seq id no:14)
[0181]
[0182][0183]
rsv_f-dn5b_04(seq id no:15)
[0184][0185]
rsv_f-dn5b_05(seq id no:16)
[0186]
[0187][0188]
rsv_f-dn5b_06(seq id no:17)
[0189][0190]
rsv_f-dn5b_07(387)(seq id no:18)
[0191][0192][0193]
在第0天用1μg/ml质粒dna瞬时转染1ml hek293f细胞培养物，并在37℃、125rpm振荡、8％co2和70％湿度下孵育。在第5天，通过在室温下以4000g离心5分钟来收获细胞。无菌过滤(0.45μm)上清液并丢弃细胞。
pathog.2015年7月10日；11(7):e1005035.doi:10.1371/journal.ppat.1005035.ecollection 2015)，而4d7对rsv f的一种与融合前结构互相排斥的构象具有特异性(flynn等人,2016,plos one.2016年10月20日；11(10):e0164789.doi:10.1371/journal.pone.0164789.ecollection 2016)。这些数据表明rsv_f-dn5b_07(387)的rsv f部分仅处于融合前构象。
[0199]
热应力后mab结合的保留
[0200]
rsv f融合前构象的稳定性通常通过测定在升高温度下孵育抗原1h后保留的融合前特异性mab结合的分数来测定(joyce等人,nat struct mol biol.2016sep；23(9):811-820.doi:10.1038/nsmb.3267.epub 2016年8月1日；marcandalli等人,cell.2019/3/7；176(6):1420-1431.e17.doi:10.1016/j.cell.2019.01.046)。我们比较了rsv_f-dn5b_07(387)与我们先前公开的ds-cav1
–
i53-50a(309)蛋白的融合前稳定性。使用含有5％甘油作为稀释剂的dpbs将309和387的浓度归一化至0.16mg/ml(2μm)。将样品在热循环仪中于20℃、50℃、70℃或80℃下孵育1小时。在孵育后，将样品在含有0.5％脱脂牛奶(bio rad，印迹级封闭剂)的hps-ep+缓冲液(fort
è
bio)中稀释10倍至200nm，然后将200μl每种样品铺在黑色96孔板(grenier)中。将d25单克隆抗体(mab)在含有0.5％牛奶的hps-ep+缓冲液中稀释至10μg/ml，并将200μl mab铺在黑色96孔板的8个孔中。使用biolayer interferometry(bli)仪器(octet，red 96)将蛋白a生物传感器(fort
è
bio)浸入mab孔中，以将抗体固定至生物传感器。然后将生物传感器浸入缓冲液(参见稀释缓冲液)中以获得基线，然后浸入样品孔中以观察结合(缔合)。最后，将生物传感器再次浸入缓冲液中，以便观察样品与mab的任何潜在解离。将在50℃、70℃或80℃下与20℃下孵育后1500秒时的结合比率用于计算相对结合。图4a示出了每个样品的缔合和解离曲线。图4b示出了描绘在每个升高温度下的反应性分数的条形图。数据显示387在50℃下1小时后比309保留更多的d25结合。两种蛋白质在70℃或80℃时都失去了大部分d25结合。数据表明rsv f抗原的融合前构象在387中比在309中更稳定。
[0201]
细菌表达系统表达和纯化i53_dn5a
[0202]
为了表达i53_dn5a组分，将以5'至3'顺序含有以下物质的质粒转化入bl21*(de3)感受态细胞(new england biolabs)：ndei限制性酶切位点、orf、xhoi限制性酶切位点、pet29b+载体中的6xhis标签。通过将菌落转移至培养基，在含有50μg/ml卡那霉素的terrific broth(tb)中制备起始培养物。将起始培养物在37℃下以250rpm振荡孵育过夜(约16小时)。我们使用tb进行表达培养，同样包含50μg/ml卡那霉素。将表达培养物在37℃下以250rpm振荡孵育约2小时，直到光密度(od600)达到0.6-0.8，此时添加1mm iptg诱导表达。将培养物在18℃下再孵育18小时。在2l带挡板的摇瓶中生产500ml表达培养物(产量约0.1g/l)。通过以4000g离心15分钟收获细胞。倾析培养基并将细胞沉淀储存在-20℃下直到纯化。
[0203]
为了从宿主细胞污染物纯化组分，首先将细胞沉淀重悬于20ml裂解缓冲液(25mm tris ph 8.0、150mm nacl、5％甘油)中，并使用thunderstick
tm
以10000rpm匀浆30秒。使用微流化器在18000psi下裂解细胞。通过在4℃下以24000g离心30分钟来澄清溶胞产物，然后以0.22μm无菌过滤上清液并丢弃沉淀。如下使用固定化金属亲和色谱法(imac)纯化滤液。首先，在将树脂平衡到25mm tris ph 8.0、150mm nacl、30mm咪唑、5％甘油(洗涤缓冲液)中
后，将澄清的溶胞产物施加至2ml的ni2+-nta柱床体积。然后，通过将12倍柱体积的洗涤缓冲液施加至树脂床来清除柱中的宿主细胞蛋白质。最后，用7倍柱体积的洗脱缓冲液(25mm tris ph 8.0、150mm nacl、500mm咪唑、5％甘油)从树脂上洗脱所述组分。
[0204]
为了进一步纯化目的蛋白质，如下进行尺寸排阻色谱法(sec)。首先在akta pure
tm fplc(ge healthcare)上用1.2倍柱体积的洗脱缓冲液(25mm tris ph 8.0、150mm nacl、5％甘油)平衡superdex
tm 200increase 26/600gl sec柱(ge healthcare)。使用10k
·
mwco浓缩器(amicon，sartorius)，将imac
tm
洗脱液浓缩至10ml，然后使用0.22μm过滤器灭菌。使用fplc上的样品泵以3.2ml/min的流速将样品施加至sec柱。最后，通过使用fplc在柱上运行1.2倍柱体积的洗脱缓冲液来洗脱所述组分，保持流速为3.2ml/min。洗脱的目的蛋白质大约210ml。
[0205]
ds-cav1
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i53_dn5纳米结构的体外组装
[0206]
使用纯化的rsv_f-dn5b_07三聚体组分和纯化的i53_dn5a五聚体组分，通过在1ml反应中为50μm，以1:1摩尔比(根据亚单位计算，不是寡聚体)混合各组分，来组装纳米颗粒。组装反应设置如下：首先，将三聚体组分添加至1.5ml微量离心管中，然后将缓冲液添加至管(25mm tris ph 8、250mm nacl、5％甘油)中，随后添加五聚体组分。在如下收集动态光散射(dls)读数之前，将反应物在4℃下孵育约1小时。使用dynapro
tm nanostar和1μl石英比色皿(wyatt technology corp.)，在25℃下进行粒度测量。使用激光的自动衰减，将样品测量3次，其中每次测量采集10次，每次采集5秒钟。图5显示未纯化的体外组装反应包含具有预期半径(23nm)和低多分散性的主要产物，表明成功组装成目标二十面体纳米结构。