Sanger测序除了序列测定还有什么用途

作者：杨超月

Sanger测序法即双脱氧链末端合成终止法（chain termination method），是经典的DNA一代测序方法，在DNA复制过程中掺入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为测序反应的链终止剂，产生一系列末端终止的DNA链，能通过电泳按长度分辨。不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的，根据待测序列区的长度、所要求的测序精确度，采用四种荧光染料标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后得到所目的的碱基序列。

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图1 引物延伸时被引入含各色荧光标记的终止碱基，形成单碱基差异片段

Sanger检出结果：

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那除了序列测定外，还有哪些用途呢？ 毛细管电泳（CE）其实就是凝胶电泳的升级版，分辨率更高而已，所以可以用于片段分析。检测原理：在靶向扩增引物的5‘端标记各色荧光，对靶向产物进行扩增，对产物进行片段分析，通过各色荧光计片段大小来区分目标基因或序列。

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图2 不同荧光标记片段检出结果

微卫星标记(Microsatellite),也称为短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR)，是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列。1-5个核苷酸为重复单位串联组成核心序列，重复数为10~20，核心序列两侧是较保守的侧翼序列，可在此处设计微卫星引物。

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微卫星不稳定性（microsatellite instablility，MSI）是指由于复制错误（replication error，RER）引起的简单重复序列的增加或丢失，也称RER阳性或RER表型。1993年，Altonen等首次发现，在HNPCC细胞中存在高频率的MSI后，又有很多学者在多种肿瘤中发现MSI。MSI作为肿瘤遗传不稳定一个敏感的检测指标已逐渐被大家接受。

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图3 通过检出片段分布不一致区分肿瘤样本与正常样本

单核苷酸多态性主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

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图4 引物末端延伸，通过添加不同终止碱基来区分突变

ABI毛细管电泳（CE）方法用途广泛，为何渐渐被遗忘，我想主要有以下因数：基于引物扩增的方法，使用重复碱基引物扩增的效率较低，多重荧光法对引物要求较高，特异性要好，可使用的荧光信号少，同时可检测的片段较少，通量低。此外检测分辨率上，对于1-2个碱基偏差敏感度较低，很多时候难以区分。虽然有很多缺点，如果试剂性能良好的情况下，相较操作较为简单，快速，硬件要求低，检出结果准确度高、实验成本也低。