基因拟南芥差异表达基因

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

植物在生长过程中不可避免地会受到生物胁迫 (由生物引起，如病菌、虫害等) 或非生物胁迫 (由一系列过度或不足的物理、化学条件变化所引发的不利于植物生长发育的影响因素，如干旱、高温、冷害、冻害等)，它们都能影响植物的生长、发育而降低产量。植物根据特定的环境胁迫进化出多种适应性的分子机制 (通过激活或抑制特定靶基因改变其表达量)[]来响应不同的非生物胁迫。植物感知到胁迫后通过信号转导来激活胁迫响应相关基因的表达，参与胁迫应答基因表达调控的核心组件包括激酶、磷酸酶和转录因子 (Transcription factor) 等[]。转录因子是能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其下游基因的转录。WRKY、MYB、bZIP和NAC等多种转录因子都能参与调控植物生长发育并提高植物抗逆性。

Souer等最先在矮牵牛Petunia hybrid V. 中分离出NAC转录因子，命名为NAM[]。1997年Aida等[]报道了NAC (NAM，ATAF1/2和CUC) 转录因子的结构域，并命名为NAC。NAC转录因子是具有多种生物学功能的植物特有的转录因子[]，具有参与调控植物发育 (胚、茎尖、侧根形成，生长素信号转导和叶片衰老等)[-]、抵抗生物胁迫[]与非生物胁迫 (干旱、高盐、低温、高温、高光、ABA)[-]等功能。在植物响应生物、非生物胁迫过程中，NAC转录因子通过调控多个下游基因的表达提高植物抗逆性。拟南芥Arabidopsis thaliana L. NAC家族中的ANAC019、ANAC055和ANAC072转录因子通过调控MYB2和MYB108转录因子的表达响应胁迫、调节叶片的衰老[]。ANAC096转录因子通过调控RD29A的表达提高转基因拟南芥干旱和渗透胁迫抗性[]。ChIP-Seq数据显示大豆 Glycine max cv. Williams 中有72个基因可能受NAC转录因子调控，RNA-Seq结果表明受NAC转录因子调控的差异表达基因包括脂肪氧化酶基因、果胶甲酯酶抑制剂基因、DEAD/DEAH解旋酶基因等[]。

实验室前期从辽宁碱蓬Suaeda liaotungensis K. 中克隆了SlNAC1基因，通过农杆菌转化法获得了转SlNAC1基因拟南芥，转SlNAC1基因提高了拟南芥在盐、干旱、冷胁迫下的存活率[]，认为转SlNAC1基因拟南芥抗逆性增强。本文以转SlNAC1基因拟南芥为实验材料，通过基因芯片技术筛选其与野生型拟南芥的差异表达基因，希望从差异表达基因中确定NAC转录因子调控的下游基因，进而分析NAC转录因子的调控网络。

1 材料与方法 1.1 实验材料

野生型拟南芥Arabidopsis thaliana L. 为哥伦比亚生态型 (Columbia-0) (命名为WT) 和转SlNAC1基因拟南芥 (命名为L2)。

1.2 拟南芥幼苗培养与取材

取适量的WT和L2种子分别用70%乙醇浸泡30 s，ddH2O冲洗3遍，再用10%次氯酸钠浸泡5 min，ddH2O冲洗7遍。灭菌后的种子分别播种于MS培养基中，置于培养箱中培养 (22 ℃，光照16 h，黑暗8 h)，至6片叶子后将其转移至含有蛭石的培养钵中。用清水浇灌幼苗，每5 d浇灌1次，20 d后取样。分别从WT和L2拟南芥株系的3个植株中取材，每株取1片叶子，每个株系共取3片叶子，迅速置于液氮中，-80 ℃保存。

1.3 芯片实验

采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒分别提取WT和L2叶片总RNA。NanoDrop ND-2000分光光度计及Agilent Bioanalyzer 2100检测总RNA的质量，对总RNA中的mRNA进行放大、标记，用RNeasy Mini Kit纯化标记后的cRNA。按照Agilent表达谱芯片配套的杂交标准流程和配套试剂盒进行杂交和洗涤。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner进行扫描。用Feature Extraction software 10.7读取数据，最后对质控合格的数据采用Gene Spring Software 12.6.1进行归一化处理，算法为Quantile。以Fold change≥2或Fold change≤0.5为标准筛选差异表达基因。本实验由上海伯豪生物技术有限公司完成，所用芯片为Agilent拟南芥全基因组4×44K芯片，每个样品各做一张芯片。在Agilent表达谱芯片实验中，用10次重复探针点信号的CV值来计算芯片的稳定性和技术的稳定性，其质控标准是平均CV＜10%，相关系数r2>0.95。

1.4 聚类分析

对差异表达2倍以上基因中的WRKY、DREB和MYB等转录因子运用SAS在线分析系统进行聚类分析，并用Tree View软件来显示聚类结果。

1.5 GO富集分析

对差异表达5倍以上基因进行GO富集分析，对细胞组分、分子功能和生物学过程中差异表达基因个数进行统计并绘图。满足P<0.05条件的GO term定义为在差异表达基因中显著富集的GO term。

1.6 KEGG富集分析

对差异表达2倍以上的基因进行KEGG富集分析，把差异表达显著的基因通路进行富集(筛选的标准为P<0.05)，统计涉及该通路的差异表达基因的个数、确定通路中的差异基因并对其进行初步分析。

1.7 实时荧光定量PCR