组织培养一般分为五个步骤:



1)培养基的配制

培养基的成份随植物的种类、外植体的类型、培养阶段的不同而不同。一般来说,培养基应含有大量元素、微量元素、铁盐、维生素、激素、糖和琼脂等物质,有时还在培养基中添加有机附加物,如活性炭、椰子汁等。培养基的配制按如下步骤进行:

(1)根据培养材料确定培养基。一般可先试用MS培养基,若不适,再改用其它培养基。

附:MS培养基——A组:(大量元素)(单位:mg·L-1,下同)

NH4NO3 1650 ;KNO3 900 ;CaCl2 440 ;MgSO4·7H2O 370;KH2PO4 170

B组:(微量元素)

KI 0.83 ;H3BO3 6.2 ;MnSO4·H2O 22.3 ; ZnSO4·7H2O 10.6

C组:

Na2MoO4·2H2O 0.25 ;CuSO4·5H2O 0.025  ; CoCl2·6H2O 0.025

D组:

EDTA 37.3  ; FeSO4·7H2O 27.8

E组:(有机物)

甘氨酸(C2H5NO2) 2.0 ; 盐酸硫胺素(VB6) 0.1 ; 烟酸 0.5

吲哚乙酸(VB1) 1-30 ; 盐酸吡哆醇 0.5 ; 6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA) 0.04-10 ; IAA(吲哚乙酸) 0.01-3

其他溶液的配制:1mol/L的NaOH溶液,0.1mg/mL的6-BA溶液,0.1mg/mL的IAA溶液,0.1mg/mL的2,4-D溶液,0.1mg/mL的KT溶液,0.1mg/Ml的ZT溶液。

(2)按照确定的培养基配方配制培养基,一般包括溶化琼脂、加入蔗糖和母液、调整酸碱度、定容、分装等步骤。

(3)对分装好的培养基进行高压灭菌,将灭菌好的培养基放入接种室中。

2)无菌培养物的建立

(1)外植体的切取及消毒。用于快速繁殖的外植体可以是种子、茎尖、叶片、花序等。外植体必须先进行消毒,其消毒方法是:从植株上切取所需的部分,用水冲洗干净,而后移入超净工作台中用消毒剂(次氯酸钠、氯化汞、酒精等)进行消毒,但不管使用什么消毒剂,消毒后的外植体应该是无菌的,而其本身没有被消毒剂杀死。

(2)将消毒后的外植体接种到培养基中,接种时要求迅速准确,防止交叉污染。

3)中间繁殖体的诱导和增殖

消毒后的外植体在培养基上培养一段时间后可诱导出从芽、胚状体、原球茎、根状茎,这些培养材料称为中间繁殖体。对中间繁殖体进行切割、继代培养就可以进行中间繁殖体的增殖。中间繁殖体的增殖速度随花卉的种类、培养基、培养条件的不同而异,因而对具体花卉需进行试验,找到合适的繁殖条件,以达到“快繁”的目的。

4)生芽、壮苗与生根

当中间繁殖体增殖到一定数量后快速繁殖进入生芽、壮苗和生根阶段。如果是通过从芽繁殖,则不需经过生芽直接进行壮苗、生根,如果是通过其它途径则需先将中间繁殖体转移到生芽培养基上,然后再转移到壮苗生根培养基上。在壮苗生根培养基上,大多数花卉要分离成单苗。

5)试管苗移栽和管理

对已经生根的试管苗及时移栽是花卉快繁的最后工作,而且也是十分关键的工作。由于试管苗是在无菌、有营养供给、适合光照、温度和100%相对湿度环境中生长的,因而刚出瓶的试管苗对外面环境不太适应,稍一不慎便会造成大量死苗。所以对刚出瓶的试管苗要给予特别的照顾,适当的温度、弱光照、高的空气湿度、适宜的基质及对病虫害的有效控制是提高成活率的关键。




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