第三章：酶的分离纯化.ppt

作者：张馨予

第三章：酶的分离纯化.ppt

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文档编号：2279828

上传时间：2021-01-02

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1、第三章酶的分离纯化酶分离纯化的目标使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度要点酶主要还是蛋白质能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶要尽量减少酶活损失要分清是胞内酶还是胞外酶根据酶的用途采用不同的方法 3 1酶分离纯化流程酶原液否胞内酶细胞破碎提取分离浓缩干燥预处理细胞分离 3 2酶纯度的评价总活力的回收率比活力提高的倍数酶的纯度实用价值侧重科研 3 2 1酶总活力回收率与提纯倍数 1总活力的回收率反映提纯过程酶活力的损失情况总活力的回收率纯化后总活力纯化前总活力 100 2提纯倍数反映纯化方法的效率纯化倍数纯化后的比活纯化前的比活示例腺

2、苷酸激酶纯化表 6kg猪肉纯化步骤总体积总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率抽提16600435000 04130 951100 mlmgkatalkatal kg 调pH15700112003 25 层析1380171613 02 凝胶过滤21146243 17 结晶 34446 5 3 2 2酶的纯度检验注意标明使用何种方法检验的不同方法检验的纯度可能不一致如电泳纯层析纯 HPLC纯常用的检验酶纯度的方法方法特点超速离心检测杂质 5 时不太满意不适合络合解离体系电泳必须在多种pH值下进行单一pH两种酶可能一起移动 SDS 电泳可测出分子量多亚基时会出现多条区带等电聚

3、焦检测杂的极灵敏方法有时会出现表观异质现象 N 末端分析只适用于一条肽链免疫技术高度的专一性但抗血清制备较为麻烦 3 3分离与纯化分离提取在一定条件下用适当的溶剂处理含酶原料使酶充分溶解到溶剂中纯化通常先根据溶解度性质用沉淀的方法如盐析有机溶剂沉淀等制得粗酶再根据酶分子的大小电荷性质亲和专一性将酶纯化 3 3 1细胞破碎的方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法P72 73 3 3 2酶提取的方法盐溶液提取法酸溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法p76 根据酶的溶解性质选择适当的溶剂 3 3 3影响酶提取的主要因素 1提取目标提高提取率减少酶活损失

4、 1 温度温度过高易导至酶失活应控制在0 10 对于稳定性高的酶提高温度有利于提取 2 pH pH应远离等电点以提高溶解度但pH不宜过高或过低防止酶失活 3 提取液用量用量增加提取率增加但分离成本提高一般为原液的3 5倍4 添加保护剂加入适量的酶作用底物辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性减少酶活损失 1分离过程中新设备新技术的应用会取得事半功倍的效果如离心机过滤机的选择采用膜分离技术等 2 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失活同时可添加一些保护剂以减少酶失活提取时的注意事项 3 4沉淀分离沉淀分离方法盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀复合沉淀选择性变性剂沉淀 3

5、 5离心分离借助于离心机旋转所产生的离心力使不同大小密度的物质分离的技术常用于细胞收集细胞碎片和沉淀的分离及酶的纯化选择离心分离注意选择适当的离心机离心方法离心条件 3 5 1离心机的种类和用途常速离心机转速在8000r min内高速离心机转速在1x104 2 5x104r min内高速离心会导致温度升高因为防止酶等失活有的装有冷冻装置超速离心机转速在2 5x104 8x104r min内都装有冷冻装置和其它一些控制系统常速离心机高速离心机超速离心机超速离心机又可分为制备用超速离心机分析用超速离心机分析制备两用超速离心机分析用超速离心机可用于样品

6、纯度的检测沉降系数和分子量的测定分析用超速离心机一般都装有光学检测系统自动记录仪和数据处理系统等沉降系数单位离心力作用下粒子的沉降速度 Svedberg S 1x10 13s 角速度 t2 t1离心时间 X1 X2粒子距中心轴的距离 3 5 2离心方法的选择p82 常速和高速离心机只要选择合适的速度和时间就可以了而对于超速离心机离心方法可分为差速离心密度梯度离心和等密度梯度离心 1 差速离心采用不同的离心速度和离心时间使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒操作简单方便但分离效果较差并使沉降的颗粒受到挤压 2 密度梯度离心p82 是样品在

7、密度梯度介质中进行离心的方法能使沉降系数比较接近的物质得以分离 0 1 n线性梯度离心还有凹形梯度和凸形梯度不同大小和形状的颗粒在密度梯度溶夜中形成若干条界面清楚的区带密度梯度系统可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯度系统要求介质有足够大的溶解度不与组分反应且不会引起分离组分的凝集变性或失活常用的介质有蔗糖和甘油蔗糖的梯度范围为浓度5 60 密度为1 02 1 30g cm3 3 等密度梯度离心p83 当分离组分的密度 i时下沉而 i颗粒停留在该处形成区带使得待分离的物质处于离心介质等密度处 i形成区带的离心方法要求溶液的密度比较大要等于分离组分的密度因此常用銫