万字干货，关于PCR基因扩增仪的一切

作者：张馨予

PCR是分子生物学研究极其重要的工具，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制，即人为创造核酸半保留复制条件，使目的DNA在细胞外完成扩增的过程，它可被看作是生物体外的特殊DNA复制。

PCR也叫基因扩增仪，主要用于用于科研及临床的基因扩增、定性PCR基因扩增、荧光/酶免终点定量DNA基因扩增、基因芯片等其他基因分析应用的基因扩增等。基因扩增仪适合国内外各种PCR试剂盒传染病类、肿瘤类、科研类。进口基因扩增仪主要由外壳、变温反应腔、散热系统、加热系统、制冷系统、电子控制系统、供电系统、人机界面等各部分组成。基因扩增仪广泛应用于各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

今天小谱就其发展史、检测原理、结构和大家进行探讨，让基因扩增仪变的更简单。

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“基因扩增仪”的诞生和发展

核酸体外扩增的设想最早是由Khorana在1971年提出的。“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”

然而当时还没有成熟的基因序列分析方法，也没有热稳定DNA聚合酶以及引物合成操作很困难。这种设想达不到实际的效果。并且在70年代初出现了分子克隆技术，一种克隆和扩增基因的途径被提供了，因此人们遗忘了Khorana的设想。

1983年4月的一个星期五晚上， Kary Mullis开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法；

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的diyi个PCR片段；

1985年， Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼；

1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是diyi发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了diyi篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

根据PCR原理，商业公司在PCR仪的基础功能上不断进行创新和改进。至今，PCR仪已经更新至第三代技术。为方便读者朋友理解，本文将对三代PCR仪的原理、特点、主要厂商及产品、应用领域做一系统梳理。

第一代——标准PCR仪

▲ 标准PCR反应过程

标准PCR仪也叫做终点PCR仪，是指目的基因仅经过预变性、变性、退火、延伸阶段产生大量的核酸序列的PCR仪，PE-Cetus公司推出的世界上第一台PCR自动化热循环仪属于此种。根据PCR退火温度和扩增条件(细胞内/外)，标准PCR又可以分为三类：普通PCR、梯度PCR和原位PCR。

第二代——qPCR(实时定量PCR)

1996年Applied Biosystems(现被赛默飞收购)公司推出了实时荧光定量PCR(RTFQ PCR)技术，并发明了世界上第一台荧光定量PCR仪，开始了从定性到定量的跨越。

实时定量PCR仪是指在PCR反应体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料(SYBR Green等)或荧光标记的特异性的探针(TaqMan Probe等)，在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量PCR功能的仪器，通过对PCR过程中产生的荧光信号积累实时监测整个PCR过程，再结合相应的计算机软件对所获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品特定DNA片段的初始浓度。

目前根据荧光信号反应样品浓度主要有两种方法：

1.Taqman探针法

探针两端分别为报告荧光基团R和荧光淬灭基团Q，当探针完整时，R发出的荧光被Q吸收，检测不到荧光信号。探针随机结合到DNA单链上，PCR扩增时，探针被水解，R与Q分离，R发出的荧光就会被检测到。每扩增一条DNA链都会生成一个荧光分子。

2. SYBR Green Ι染料法

SYBR Green Ι是一种只有在和双链DNA结合时才会发荧光的染料。在PCR变性时，无荧光产生，到了复性和延伸阶段则能检测到荧光信号。