【评测】CRISPR/Cas9基因编辑系统

作者：杨超月

CRISPR/Cas9已经成为最常用的基因编辑系统。CRISPR/Cas9包括2部分：Cas9核酸内切酶和sgRNA(single guide RNA)，sgRNA由天然的tracrRNA (transactivating crRNA)和crRNA (CRISPR RNA)融合而来。

使用CRISPR/Cas9工具进行基因敲除等基因编辑时，首先要进行sgRNA设计。理论上只要根据PAM序列(SpCas9识别的最佳PAM是5-NGG-3)对所需靶向的物种基因组进行扫描，即可设计所有可能的sgRNA。但如何设计合理有效的sgRNA则需要谨慎考虑，因为这将决定其基因编辑结果。

随着近年来研究的不断深入，研究者对CRISPR/Cas9系统机制已有非常全面的了解。这些研究结果也促进了大量的sgRNA设计工具的出现[1,3]，从而给研究者提供了快速、高效的sgRNA设计选择。 sgRNA的5’包括20nt的protospacer序列，该序列和靶向DNA序列互补以实现双链切割；其3’则为固定的一段具有茎环(stem-loop)结构的支架序列(scaffold sequence)，该序列和Cas9蛋白带正电的凹槽相互作用形成核糖核蛋白复合物(ribonucleoprotein complex, RNP)。一般sgRNA序列大多指20nt的protospacer序列。大部分的sgRNA设计工具，除展示设计序列外，主要包括效率和特异性评价，并给出参考评价分值。而不同工具所基于的数据和算法，导致给出特异性和效率结果可能不同。由于sgRNA特异性主要取决于是否存在潜在的错配序列，不同工具间结果一致性往往较高；但是对于效率预测，目前并没有非常成熟的预测工具，研究者使用时需要谨慎参考。

在工具设计页面上，不同的工具偏重点不同。很多工具提供不同的物种基因组序列，可使用基因ID直接获得sgRNA；或者通过输入候选序列进行sgRNA设计。并且大都能提供多种CRISPR/Cas系统以供设计。

IDT---合成生物学领域的引领者

Integrated DNA Technologies （以下简称“IDT”）引领生命科学研究 30 余年，研发和生产众多核酸产品，如今绝对是行业的佼佼者，那么深得客户信任的IDT是如何做到高覆盖度，高均一性，高捕获率的“三高”呢！今天小编就带您就来了解下它的核心。

IDT---合成生物学领域的引领者

美国IDT公司，总部位于美国爱荷华州科勒尔维尔，成立于 1987年，是基因组学领域开发的领先者，也是公认的定制核酸生产行业的领导者。下图是IDT从成立至今的重大事件图鉴（蓝色是资本并购，橙色是技术产品革新）。

历经三十年的开疆拓土，各种资本与技术并购，IDT以Oligos（寡核苷酸）的合成作为核心技术，为基因组学应用开发了专有技术，主要分为四大块，下一代测序NGS、PCR引物探针、CRISPR 基因组编辑所用到的功能蛋白，模板DNA，向导RNA等、基因片段的合成。通过 GMP 服务，IDT的产品被科学家用于研究多种癌症以及大多数遗传性和传染性疾病。

IDT作为全世界最大的Oligo合成供应商，IDT目前全球分布有5大工厂，具有世界性的布局。为100多个国家和地区的超过120,000名生命科学研究人员提供服务，每天生产70,000多条核酸产品。

IDT的合成Oligo凭借其高质量标准受到全世界科研者的青睐。IDT 采用合成柱法的方式单独合成每条Oligo，在每个碱基耦合的过程中涉及到一个“偶联效率”的概念，造就了超高的合成精度。同时IDT合成的高质量不是说出来的，严谨的质控更是将产品质量拿捏的死死的，每条Oligo通过ESI-MS(电喷雾质谱)质谱的方式，让错误的Oligo无所遁形，并且每一个通过质检的oligo都有一个质控报告，也为后期IVD客户做申报工作提供了极大的便利。

IDT 拥有专有合成平台，生产工艺中的大部分环节都由内部设计和开发，包括专门的合成器和高通量自动化系统，前者可以满足最苛刻的定制要求，后者可确保快速交付。同时，IDT不依赖第三方制造商提供合成所用的机器和化学试剂，因此能够根据需要轻松调整设备和试剂。我们交付给客户的每一条探针都经过ESI-MS的把关，保证生产出质量上乘、一致性出色的寡核苷酸。