线粒体呼吸链复合物V试剂盒(F0F1

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

检测指标：线粒体呼吸链复合物V
线粒体呼吸链复合物V（F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶）活性光谱法定量检测试剂是一种旨在使用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定与ATP 合成对应的ATP 水解产生ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光谱法测定样品中酶活性的权威而经典的
技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的F0F1-ATP 酶/ATP 合成酶的特异性活性检测。可用于心肌、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

线粒体呼吸链复合物V，通常称为ATP合成酶（ATP synthase）、F型ATP酶（F type ATPase）和F1F0 ATP酶（F1F0ATPase），是线粒体氧化磷酸化的终极反应。其分子量为500KD，含有十六个亚单位，其中两个：ATP酶6和8为线粒体DNA编码的。ATP酶主要有两个结构域：F0为质子通道，由几个膜蛋白构成，包括a、b、c、d、
e、F6、A6L、OSCP（oligomycin sensitive conferring protein）等；和F1催化活性结构域，由水溶性的α3β3γδε蛋白构成。其最特征性的酶活性是寡霉素敏感的ATP合成酶。复合物V的主要功能在于产生大部分细胞所需的能量ATP。ATP的合成需要线粒体内膜电子传递到氧分子时，呼吸链蛋白所产生的质子梯度变化。质子通过F0结构域传递到基质，激活F1催化活性结构域，促使ATP合成。该酶异常会导致心肌和神经系统疾病。基于ATP，在寡霉素参与下，受到F1F0 ATP酶的水解，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamideadenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），产生的吸光峰值的变化（340nm），来定量分析F1F0 ATP酶活性。

试剂盒组份：
缓冲液（Reagent A） ×20 毫升
反应液（Reagent B） ×2.5 毫升
阴性液（Reagent C） ×2 毫升
底物液（Reagent D） ×500 微升
专性液（Reagent E） ×250 微升

注意事项
1．本产品为21 次操作（10 个样本），包括1 次背景对照
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1 次
4．线粒体样品检测前，建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3 次
5．如果增强酶活检测，建议使用线粒体复合物待测样品预处理试剂盒
6．建议线粒体悬液使用0.25 M SUCROSE 和2 mM EDTA，pH9.0；忌用磷酸缓冲溶液
7．建议使用线粒体裂解悬液，而不是细胞裂解悬液。如果使用细胞裂解悬液，第一须澄清；第二须加50微克。
8．加入样品后3 秒内即刻光谱测定
9．反应1 分钟后光谱测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5 分钟
10．测定值由高到低变化，即0 分钟测定读数高于1 分钟或5 分钟测定读数，表明有酶活性
11．光谱测定后，比色皿须清洗彻底
12．建议待测样本线粒体蛋白浓度为10 微克/100 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供线粒体溶解试剂盒S10018 为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒）
13．样品特异活性是指寡霉素敏感的ATP 合成酶，去除其它干扰因素（例如复合物I/II/III/IV 等）
14．线粒体呼吸链复合物V 酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
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