一种快速提取细菌基因组DNA的方法与流程

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

本发明涉及一种提取基因组dna的方法，尤其涉及一种快速提取细菌基因组dna的方法，属于生物技术领域。

背景技术：

伴随着生物化学及分子生物学如分子克隆技术、pcr技术、基因工程以及全基因dna测序技术等的发展，对生物dna的研究也越来越广泛与深入。而基因组dna的提取往往是对生物dna研究的第一步，也是研究的基础，dna的提取质量直接决定着下游实验的成败。

细菌属于原核生物，其细胞结构比较简单，具有肽聚糖构成的坚韧细胞壁。对细菌dna提取的第一步需要破坏这层细胞壁，而释放细胞内的核酸等内容物，目前对细菌基因组dna提取的方法主要有：机械破碎法、酶法和化学法等进行细胞破碎以及dna提取。其中机械法主要是利用机械作用力如超声破碎、反复冻融、微珠震荡等方法对细菌细胞壁进行破碎；酶法主要通过生物酶如溶菌酶等对细菌细胞壁进行溶解破碎；化学法通过化学试剂如强碱naoh、表面活性剂sds(十二烷基磺酸钠)、ctab等化学试剂对细菌进行破裂、蛋白变性等结合有机溶剂抽提蛋白杂质，从而获得较高纯度的dna。

目前对细菌基因组提取最常用的方法即ctab-酚氯仿抽提法，由于其操作所用的试剂方便易得，无需用到复杂的实验仪器，价格相对低廉，因而成为细菌基因组dna主要的提取方法。其主要提取步骤包括：收集菌体、破壁、抽提、沉淀、洗涤、干燥、溶解等多步，其主要方法包括(以提取大肠杆菌基因组dna为例进行介绍)：收集菌体1、划线菌种至lb固体培养基，置于37℃培养箱倒置培养过夜待长出菌落后，挑取菌落至lb液体培养基，37℃摇培约12小时至稳定生长期，取1.5ml菌液至2ml离心管，12000rpm，离心5min，弃上清，收集菌体；破壁2、加入600μl1xte溶液重悬菌体，12000rpm，离心5min，弃上清；3、加入450μl1xte溶液、50μl10mg/ml溶菌酶和10μl100mg/ml的蜗牛消化酶与菌体混匀，37℃孵育1h；4、加入600μltens裂解液，以及与沉淀等体积的玻璃珠，混匀，涡旋震荡10min后，加入30μl20mg/ml蛋白酶k，混匀，55℃孵育1h，5、4℃12000rpm，离心5min，转移上清至新的1.5ml离心管；抽提6、加入等体积的有机溶剂酚、氯仿、异戊醇(25：24：1)充分混匀，静置2min后，4℃，12000rpm，离心5min；沉淀7、转移上清至新的1.5ml离心管，加入0.8倍体积的异丙醇，-20℃沉淀2h，4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。洗涤8、加入600μl预冷的70％的乙醇，颠倒混匀，洗涤dna沉淀，12000rpm，离心5min，弃上清，并重复洗涤1次。干燥及溶解9、吸干离心管中的液体，晾干，加入30μl无菌水及0.5μl10mg/ml的rnasea，混匀保存至-20℃冰箱。其中tens裂解液成分：100mmtris-hcl(ph8.0),50mmedta，200mmnacl，2％(w/v)sds(十二烷基磺酸钠)，0.5％(v/v)tritonx-100。然而此方法比较费时费力，所用试剂较多，一些试剂如酚、氯仿、异戊醇等有机溶剂有毒，且有刺激性气味，需在通风橱中操作，一些酶的价格较贵，花费较多，投入成本较大，且整个过程步骤较繁琐，花费时间较长，整个提取过程需要花费4、5个小时才能完成，影响实验进程。基于此，亟待对提取dna方法进行优化，使其能简易、方便、快捷，缩时、低成本，并且保证dna的产量、质量，能够使提取的dna进行下游的pcr、菌种鉴定等实验。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明对之前的细菌dna提取方法进行了优化，提供一种快速提取细菌基因组dna的方法。

本发明所述的快速提取细菌基因组dna的方法，步骤是：

1)破壁：刮取待提取的生长于培养基上的细菌菌落或离心收集处于生长对数期的菌体，以湿菌0.5～10mg:500μl提取液的比例将收取的细菌浸于dna提取液中，60-80℃条件下放置5-30min，破碎细胞；其中所述dna提取液的配方是：150±20mmtris，30±5mmedta，1％(w/v)sds，用盐酸调ph值为7.7～8.0；

2)沉淀：将步骤1)处理的菌液以12000±2000rpm离心5～10min或静置，吸取上清液移至新的离心管，其过程中避免吸到破碎的菌体，然后再加入吸取液等体积的异丙醇，颠倒混匀，4℃，12000±2000rpm离心5～10min，弃上清；

3)干燥与溶解：将弃上清后的离心管中残留的液体充分吸净，放置离心管使其自然晾干或在超净台中将离心管吹干，然后加入灭菌的ddh2o溶解dna，获得含有细菌基因组dna的溶液。

上述快速提取细菌基因组dna的方法中：所述湿菌与dna提取液的比例优选是湿菌2-8mg:500μl提取液。进一步优选的实施方式是所述湿菌与dna提取液的比例是湿菌5mg:500μl提取液。