Western实验步骤

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

Western实验步骤

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，常简写为WB，是用抗体检测蛋白表达的重要方法之一。碧云天试剂总结Western实验步骤可如下进行操作。
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

根据实验需要，使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013/ P0013J)、RIPA裂解液(P0013B/ P0013C/
P0013D/ P0013K)、 NP-40裂解液(P0013F)或SDS裂解液(P0013G)等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品；为了防止蛋白的降解，或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定，也可额外添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或去乙酰化酶抑制剂混合物( P1005/ P1006/P1045/ P1046/ P1112/P1113)。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒( P0027和P0028)、细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(P0033)、细胞线粒体分离试剂盒(C3601)、组织线粒体分离试剂盒(C3606)。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒( P0009/ P0010/ P0010S/ P0011/ P0012/ P0012S)、 Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(P0006C)。

2.电泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天试剂、天能SDS-PAGE凝胶预制胶、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0012AC)。这两种试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。更方便的，可以使用碧云天的各种浓度规格的预制胶产品( P0050/ P0051/P0052/ P0053/ P0055/ P0056/ P0057/ P0058)。

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)或 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X) (P0015L)。如果是非变性样品，可以使用非变性PAGE蛋白上样缓冲液(P0016)或非变性非还原性蛋白上样缓冲液(P0016N)。

100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳

蛋白样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

碧云天提供各种预染蛋白质分子量标准用于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。最好使用彩色预染蛋白质分子量标准(P0068/P0069/P0071/P0072/ P0075/P0076/P0077/P0078/P0079/P0080)或预染蛋白质分子量标准(P0066/ P0067)。

电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer )