体外原代培养人视网膜色素上皮细胞

作者：杨超月

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目的:探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术.为研究溶血磷脂酸(1ysophos phatidic acid,LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用.方法:取自愿者贡献的意外事故成年眼球,用2.5g/L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞接近融合状态时进行传代培养.取自愿者贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞,用DMEM加100mL/L血清及MEM 氨基酸和庆大霉素,进行细胞传代培养.用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF-β2)及LPA+TGF β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验,用细胞染色法进行细胞计数,提取视网膜色素上皮细胞DNA,用Spectrophotometer进行DNA定量测定.结果:RPE原代细胞镜下为圆形,大小不一,内含较多的色素颗粒,胞核无法辨认.原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快,至4～5d即可基本融合,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少.第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛,细胞质内细胞器丰富,线粒体量多,体积较小,内外膜分界清晰,嵴较短.色素颗粒散在分布于胞浆内,多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物.LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用.含有和/或缺乏10mL/L小牛血清的两种LPA(10 μ mol/L)均明显刺激视网膜色素上皮细胞增殖,但这种细胞的增殖被TGF-β2所抑制,LPA(10μmol/L)引起视网膜的色素上皮细胞DNA合成增加是正常对照组的两倍.结论:溶血磷脂酸可促进人类RPE细胞体外培养的增殖,第3代培养的视网膜色素上皮细胞可保留原代细胞的生物学特性.LPA对视网膜色素上皮细胞DNA合成增殖作用提示:血清中的LPA在视网膜损伤愈合及增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的增殖过程中起重要的作用.