细胞的原代和传代培养以及细胞计数

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

实验原理

1. 细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

2. 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以 1:2 或 l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增 3～6 次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100 个细胞。一般细胞分裂指数介于 0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达 3～5％。细胞接种 2～3 天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。

3. 体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如 HeLa 细胞、NH3T3 等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如 HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。

4. 在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。

主要试剂

含有 5％小牛血清的 MEM 培养液、0 .01mol／L PBS，0 .25％胰蛋白酶一 0.02％EDTA 混合消化液、75％乙醇、0.3％台盼兰染液。

主要设备

手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

实验材料

乳兔、HeLa 细胞(人宫颈癌细胞)。

实验步骤

1. 原代细胞培养

(1) 取材用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有 75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中；

(2) 切割用灭菌的 PBS 液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成 1mm3 左右的小块，再用 PBS 清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清；

(3) 消化、接种培养吸取 0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化 8～10 分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入 5～10ml 含 5％小牛血清的 MEM 培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。

2. 传代细胞培养

(1) 将长成单层的原代培养细胞或 HeLa 细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置 5～10 分钟；

(2) 在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入 3～5ml 新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液；

(3) 将细胞悬液吸出 2ml 左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加 3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。

3. 培养细胞的形态观察

(1) 将细胞培养瓶从 37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口；

(2) 打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度；

(3) 调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是 10X 物镜。

4. 培养细胞的计数及活细胞的鉴定