抑制HBV小鼠的高病毒抗原表达可增强治疗性疫苗

作者：张馨予

图 1 HBV抗原滴度影响治疗性疫苗的抗病毒疗效。（A）慢性HBV感染患者血清HBsAg水平检测。（B-I）在高病毒载量且高抗原水平的HBV转基因小鼠（n≥6/组；HBsAg 10³-10⁴ IU/mL；HBeAg>200 PEI U/mL）中转染表达抗HBV的shRNA AAV嗜肝性质粒（shHBV）和对照shRNA。转染shRNA 8周后，为HBV转基因小鼠接种治疗性乙肝疫苗（TherVacB）。接种疫苗后第7天进行时间动力学（B&C）和终点分析（D-I）。（F）肝组织免疫组化染色结果，棕色代表core蛋白。（G）每平方毫米中胞质core蛋白阳性的肝细胞数量。（H）利用HBV特异性DNA探针对每个治疗组肝脏DNA进行Southern blot检测。（I）定量PCR检测每只小鼠肝内HBV-DNA水平。

注射AAV-shRNA 8周后，作者在小鼠体内应用了异源蛋白初始免疫-MVA载体（一种高度减毒的改良型痘苗病毒安卡拉株载体）增强的免疫治疗方案TherVacB，即基于颗粒型重组HBcAg和HBsAg两种蛋白进行初次免疫接种，并使用表达HBV核心、preS、S和不同基因型的聚合酶抗原改良的痘苗病毒安卡拉（MVA）载体进行加强免疫的治疗性疫苗接种策略。结果显示，所有小鼠的HBsAg水平和血清病毒载量均下降了1-2 log₁₀（图1B&1D），并且诱导产生了高滴度的抗-HBs（图1E）。然而，在没有shHBV预处理的情况下，TherVacB并不能降低HBV高复制水平小鼠的HBeAg水平（图1C）。在shHBV处理后，TherVacB接种能够显著降低HBsAg、HBeAg和血清病毒载量至接近检测下限（图1B-D）。为了比较两种治疗方式的抗病毒效果，作者分析了肝脏中HBV基因表达和病毒复制情况。可反映病毒复制活性的HBcAg在表达shHBV的小鼠肝细胞中染色强度减弱，而在应用TherVacB后HBcAg染色强度进一步下降（图1F&1G）。Southern blot和PCR结果显示，shHBV和TherVacB都可抑制HBV的复制，序贯使用shHBV和TherVacB可以完全抑制HBV复制（1只小鼠例外）（图1H&1J）。因此， 通过RNAi降低HBV抗原表达有助于治疗性疫苗对HBV感染的有效控制。

治疗性疫苗诱导T细胞向肝内浸润

接种TherVacB后，只有用shHBV进行预处理的HBV转基因小鼠血清丙氨酸转氨酶（ALT）水平出现了2倍升高。因此，作者通过CD3、CD4和CD8免疫组化染色分析了不同组小鼠肝组织中T淋巴细胞浸润的情况（图2A-C）。与血清ALT水平升高一致，在接种TherVacB之前用shHBV预处理的小鼠中T细胞浸润最为明显（图2A），且所有接种TherVacB的小鼠肝脏中都出现了T淋巴细胞浸润（图2C）。shHBV预处理组小鼠中CD4⁺ T细胞数量与对照组相比没有显著差异，但是CD8⁺ T细胞的浸润明显增强（图2B&2C）。同时，小鼠对AAV-shHBV和TherVacB治疗的耐受性良好，均未引起明显的组织病理学改变（图2D）。以上结果表明，通过RNAi降低病毒载量和抗原水平并不能诱导中和性抗体产生，也不能促进T细胞向肝脏的浸润。而 TherVacB接种可诱导抗体应答，RNAi联合TherVacB可诱导CD8⁺ T细胞向肝脏浸润。

抑制HBV小鼠的高病毒抗原表达可增强治疗性疫苗

图 2 接种治疗性疫苗后T细胞向肝内浸润。转染shHBV或对照shRNA 8周后，为HBV转基因小鼠接种治疗性乙肝疫苗（TherVacB），7天后处死小鼠，取肝组织进行活检。（A&B）肝组织的HE、CD3、CD4、CD8染色。（C）每只小鼠肝组织中CD3、CD4、CD8阳性细胞计数。（D）用于评估每只小鼠肝脏病理变化的组织学评分。

HBV特异性shRNA可增强TherVacB诱导的HBV特异性CD8⁺ T细胞应答

shHBV降低了HBV转基因小鼠中HBV抗原的表达，使TherVacB能够打破HBV特异性免疫耐受，并诱导HBV特异性CD8⁺ T细胞应答（图3A-F）。单独应用TherVacB可以促进肝脏和脾脏内HBV特异性CD4⁺ T细胞的活化，但只能诱导较弱的HBV特异性CD8⁺ T细胞应答（图3A、3C和3D）。MVA特异性T细胞的应答强度在疫苗接种组之间无显著差异（图3A&3B），表明CD8⁺ T细胞的耐受是由HBV抗原诱导的，并且对HBV具有特异性。无论是单独使用RNAi（图3A&3C）降低病毒载量和抗原水平还是联合可刺激宿主先天免疫的对照疫苗，均不能激活HBV特异性CD4⁺或CD8⁺ T细胞应答。只有当联合应用shHBV和TherVacB时，才能激活肝内多功能CD8⁺ T细胞对HBsAg和HBcAg的应答（图3E&3F），证明只有抗原特异性的免疫激活才能诱导HBV特异性的免疫反应。而 血清ALT水平轻度升高表明HBV特异性T细胞具有细胞毒效应（图3G）。此外，接种治疗性疫苗时基线的高血清HBV抗原水平（HBsAg>500 IU/mL, HBeAg>200 PEI U/mL）与HBV特异性CD8⁺ T细胞应答能力呈负相关（图3H&3I）。以上结果表明，TherVacB诱导的CD8⁺ T细胞应答只有在HBV抗原表达较低的情况下（如使用RNAi后）才能打破HBV特异性免疫耐受，抑制HBV复制，且不会造成明显的肝损伤。

抑制HBV小鼠的高病毒抗原表达可增强治疗性疫苗