划时代的冷冻电镜技术

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　2017年10月4日， 2017年度诺贝尔化学奖授予了英国分子生物学家及生物物理学家理查德·亨德森、美国哥伦比亚大学德裔生物物理学家约阿基姆·弗兰克以及瑞士洛桑大学生物物理学家雅克·迪波什。获奖理由是“开发出冷冻电子显微镜技术（也称为低温电子显微镜技术）用于确定溶液中的生物分子的高分辨率结构”，简化了生物细胞的成像过程，提高了成像质量。

成绩斐然实至名归

　　亨德森选择高分辨率观察生物大分子

　　现年72岁的理查德·亨德森出生于苏格兰，现为剑桥大学医学研究理事会MRC分子生物学实验室主任，发起了一场高分辨率观察生物大分子的革命。1975年，电子显微镜诞生40年之际，因亨德森在细菌视紫红质上的尝试，证明了电子显微镜在生物领域的适用性。他将未脱离细胞膜的细菌视紫红质直接放置在电子显微镜下进行观察，借助表面覆盖的葡萄糖防止真空干涸，并采用强度更低的电子束流，观察到细菌视紫红质在细胞膜上规整排列且朝向一致。

　　之后，亨德森和同事获得了细菌视紫红质较为粗糙的三维立体结构图像，这也是历史上第一张膜蛋白领域的三维结构图像。1990年，亨德森又成功地使用电子显微镜显示蛋白质的三维图像，达到原子级分辨率。这一突破性成果证明了用电子显微镜进行生物分子成像的潜力。

　　弗兰克冷冻电镜单颗粒分析的鼻祖

　　现年77岁的德裔生物物理学家约阿基姆·弗兰克，最大的贡献是让冷冻电镜技术变得具有普遍应用价值。弗兰克在1981年完成了一种算法，利用计算机识别图像把相同蛋白质的不同影子收集起来，并且将轮廓相似的图像进行分类对比，通过分析不同的重复模式将图片拟合成更加清晰的2D图像。

　　在此基础上，通过数学方法，在同一种蛋白质的不同2D图像之间建立联系，以此为基础拟合出3D结构图像，他的图形拟合程序被认为是冷冻电镜发展的基础。此外，他对细菌和真核生物的核糖体结构和功能的研究也做出重要贡献。

　　迪波什在真空环境下使生物分子保持自然形状

　　现年75岁的雅克·迪波什出生于瑞士，他的重要贡献是在真空环境下使生物分子保持自然形状。大致于1978年，迪波什开始解决电子显微镜领域的样品干涸并遭破壞的问题。如前所述，亨德森在细菌视紫红质成像上曾用葡萄糖来保护样品，但这种方法并不普遍适用。

　　迪波什得出的方法是对生物样品进行玻璃化。一般情况下，通过氢键的相互作用，水分子会在凝固过程中有序排列，形成晶体。而迪波什想到的即是在水分子相互作用之前就让其凝固，方法是将生物样品浸入事先经液氮冷却的乙烷中，这样就能使水在数毫秒之内完全凝固。这种方法得到的就不是晶体而是无定形态，而玻璃也是处于无定形态，玻璃化名称由此而来。生物样品嵌在无定形冰中，堪称留下了真实的一瞬间。1982年，迪波什开发出真正成熟可用的快速投入冷冻制样技术制作的不形成冰晶体的玻璃态冰包埋样品。1984年，迪波什首次发布不同病毒的结构图像。随着冷台技术的开发，冷冻电镜技术正式推广开来。

传统方法难以为继

　　核酸和蛋白质是生命活动的关键密码，核酸携带遗传物质，备受科学家关注，蛋白质是生命活动的主要执行者。人们对蛋白质结构的解析始于20世纪60年代。结构生物学领域有一条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物分子的原子排布，科学家们才能了解这个蛋白的功能。蛋白质结构解析的常用实验方法有两种：X射线衍射晶体学成像和核磁共振成像。

　　作为最早用于结构解析的实验方法之一，X射线衍射晶体学成像运用了几十年。X射线是一种高能短波长的电磁波（本质上属于光子束），被德国科学家伦琴发现，故又被称为伦琴射线。理论和实验都证明了，当X射线打击在分子晶体颗粒上的时候，X射线会发生衍射效应，通过探测器收集这些衍射信号，可以了解晶体中电子密度的分布，再据此获得粒子的位置信息。由于X射线对晶体样本有着很大的损伤，因此常用低温液氮环境来保护生物大分子晶体，但是这种情况下的晶体周围环境非常恶劣，可能会对晶体产生不良影响。而且X射线衍射方法不能用来解析较大的蛋白质。