甲型流感病毒非结构蛋白NS1功能研究进展

作者：张馨予

流感病毒(influenza virus)是正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属成员，为有包膜的单股负链分节段RNA病毒[]。其具有极强的传染性，可引起急性呼吸道传染病。根据病毒颗粒中核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白(matrix protein，M)抗原性的差异，流感病毒可分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3种型别。其中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)是每年季节性流感的主要病原体，自1918年起在全世界范围引起5次大的病原明确的暴发流行。IAV的非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)与病毒-宿主相互作用关系最密切，是IAV感染过程中拮抗宿主天然免疫反应的主要病毒成分，也是影响流感病毒致病性和宿主适应性的关键毒力因素[]。

IAV的NS1是由病毒第8节段RNA编码的多功能调控蛋白，存在于病毒培养上清或被感染的细胞中，但不存在于病毒颗粒中。NS1通常含有215~237个氨基酸，包含两个功能结构域，即N端的RNA结合域(RNA-binding domain，RBD)和C端的效应结构域(effector domain，ED)，两个结构域之间由7~12个氨基酸的连接区(linker region，LR)连接[]。NS1的功能主要依赖其蛋白-RNA、蛋白-蛋白相互作用，包括抑制干扰素(interferon，IFN)的转录表达；抑制IFN诱导的蛋白激酶R(protein kinase RNA-activated，PKR)和2'，5'寡聚腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase，OAS)/核糖核酸酶L(ribonuclease L，RNase L)的抗病毒作用；激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路，抑制被感染细胞凋亡；调控病毒RNA合成及病毒RNA剪接，增强病毒蛋白质合成等；与宿主蛋白相互作用，调节病毒生物学特性。因此，深入了解NS1的生物学功能及其不同变异形式对功能的影响，将为设计新型抗病毒药物和减毒疫苗奠定基础。

1 NS1抑制IFN的转录表达

宿主细胞产生IFN是一种可有效限制病毒复制及传播的抗病毒机制。病毒感染细胞后，经自分泌或旁分泌途径产生的IFN可诱导宿主细胞产生300多种具有抗病毒作用的基因表达[]。IAV的NS1抵抗宿主抗病毒应答效应主要表现在抑制IFN的合成及抑制IFN诱导表达的抗病毒基因ISG(interferon-stimulated gene)激活两方面。这两种功能主要由NS1的C端ED区执行，由于ED区存在多种变异形式，不同毒株的NS1对IFN合成及相关功能的抑制机制不同[]。在自然环境或实验室传代过程中，NS1可丢失这些机制中的一种或全部。

1.1 NS1抑制IFN基因相关转录活化因子，降低IFN转录

病毒感染宿主细胞时，宿主细胞中的RNA解螺旋酶维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)可识别并结合至细胞内双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)或5'端含有三磷酸基团的单链RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，使自身发生ATP依赖的构象改变而暴露其N端CARD结构域(caspase recruiting domain)[]，后者可被泛素连接酶TRIM25(tripartite motif-containing protein 25)[]或Riplet/RNF135(RING finger protein 135)[]泛素化，也可与TRIM25合成的多聚泛素链结合[]。经泛素化修饰的RIG-Ⅰ CARD随后与线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling，MAVS)的CARD结合，激活MAVS并使其发生低聚反应，进而激活其下游的多个激酶信号通路，最终导致细胞质中转录因子如干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)及c-Jun/活化转录因子2(activating transcription factor 2，ATF-2)的磷酸化激活及向胞核内的转运[]。这些转录活化因子在细胞核内的出现可大大增加IFN的转录表达。H5N1、2009 H1N1 pandemic(H1N1pdm)及2009年以前的部分H1N1亚型流感病毒的NS1，通过与TRIM25的卷曲螺旋域相互作用阻止其寡聚化而减少了RIG-Ⅰ的泛素化，进而抑制宿主细胞中IRF3、NF-κB及c-Jun/ATF-2的活化来减少IFN基因的转录[]。当NS1出现S42P突变时，IAV在细胞培养中的增殖能力降低，不能发挥抑制宿主细胞表达IFN及降低IRF3磷酸化水平的作用[]。

Kuo等发现，H3N2亚型流感病毒NS1虽然也可有效结合TRIM25，但不能抑制IRF3的激活及IFN的转录起始，表明NS1与TRIM25的结合并不是抑制IRF3激活所必需的[]，因此NS1与TRIM25结合可能抑制了另外的由TRIM25激活的抗病毒信号通路。Riplet与NS1的结合仅在NS1可抑制IRF3活化的流感病毒亚型中出现，且NS1与Riplet的结合表现出明显的种属限制性，人流感病毒NS1仅能与人类表达的Riplet结合而抑制RIG-Ⅰ的泛素化，不能与猪或禽源Riplet结合[]。此外，ATP依赖的RNA解螺旋酶LGP2(laboratory of genetics and physiology 2)也含有与RIG-Ⅰ相似的可识别并结合病毒RNA的结构域，但LGP2缺乏用来激活下游IRF3的可被泛素化的CARD。在无法抑制IRF3激活和IFN合成的H3N2亚型流感病毒感染的细胞中过表达LGP2，发现STAT1转录活化因子的激活受到抑制，且IFN的转录水平明显降低；在可抑制IRF3激活和IFN合成的H1N1亚型流感病毒感染的细胞中过表达LGP2，却没有表现出相同的作用[]。因此，NS1可抑制IFN基因相关的转录活化因子，减少IFN转录毒株亚型的差异及宿主差异，但具体机制仍不明确，需进一步研究。

1.2 NS1抑制宿主细胞pre-mRNA的加工成熟，减少胞质中IFN翻译模板